アンプリコンシーケンス解析のサンプル調製について

アンプリコンシーケンス解析
サンプル調製について

弊社ではアンプリコン調製に2段階PCRを用いております。
1stPCRでは、増幅対象遺伝子と相補鎖を形成する配列+MiSeqでの解析に必要な共通配列の一部を含んだプライマーを用います。2ndPCRでは、MiSeqでの解析に必要な共通配列とサンプル識別を行う為のMID配列でデザインされたプライマーを用います。
2ndPCRでは、1stPCRで得られた増幅産物の両末端にある共通配列とプライマーが相補鎖を形成します。つまり、2ndPCRは解析対象遺伝子の配列に依存しません。解析対象遺伝子を変える場合でも、1stプライマーのForward/Reverse一組を新たにデザインするだけでよく、2ndPCR用プライマーは使い回しができます。

弊社では、8サンプルが識別できる2nd用プライマーを1セットとして、多数のお客様のサンプルを同時解析できるように複数のセットを常時ストックしております。
弊社でのMiSeq利用をご検討しておられるお客様にはプライマーを1,500円(税別・送料込)で提供しております。 また、1stPCR用のプライマーセットについても、解析対象遺伝子と相補鎖を形成する配列をご連絡いただければ、無償で合成いたします。

 

いつでもご提供可能なストックプライマーセット一覧
ターゲット生物種 対象領域 データ解析方法
細菌と古細菌 16S rRNA V1/V2領域:27Fmod-338R
16S rRNA V4領域:515F-806R
QIIME解析(可視化データを納品)
細菌 16S rRNA V3/V4領域:V3V4f-V3V4r
真菌類 ITS1領域:ITS1F_KYO1 – ITS2_KYO2
(植物由来DNAは増幅しにくい)
ITS2領域:gITS7 – ITS4
(真菌類を広くカバーしているが、植物由来DNAが増幅する)
ITS2領域:fITS7 – ITS4
(gITSほど真菌類を広くカバーしていないが、植物由来DNAは増幅しにくい)
真核生物 18S rRNA
動物 Cytochrome oxidase subunit I (COI) USEARCH解析(エクセルデータを納品)
魚類 12S rRNA (MiFish)
哺乳類(※1) 12S rRNA (MiMammal)
節足動物(※2) 16S rRNA (MiInsect)
鳥類(※2) 16S rRNA (MiBird)
有尾類(イモリ類とサンショウウオ類)(※2) 16S rRNA (MiSalamander)
線虫(※2) 18S rRNA (Ecdysozoa)
陸上植物(※2) rbcL
光合成生物(主に単細胞生物)(※2) psbA
カスタム 任意の領域 (おおよそ500bp以下)
※個別対応させていただきます。
※領域による

※1 弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。
※2 自社で開発したプライマーでの解析です。

16S rRNA V4領域をターゲットとした1st PCR用のプライマー配列です。

プライマー名 配列(5’→3’)
 1st_PCR_515F  ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
 1st_PCR_806R  GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-GGACTACHVGGGTWTCTAAT

※「-」で区切られた前半部分が2nd PCR用のプライマーとの相同部分、後半が16SrRNAとの相同部分です。

各ステップの詳しい情報については、以下をご確認ください。

テンプレートDNAについて

経験上1~5ng程度のDNA量を推奨しております。
また、DNA抽出については市販のDNA抽出キットをご利用していただければ問題ございません。
弊社ではMPbio社のFastDNA SPINを中心として数種類のキットをサンプルに応じて使用しております。

他の抽出キットとの比較検証データはこちら

土壌用DNA抽出キット

PCRの条件について(各遺伝子ごとの詳細プロトコルがダウンロード可能)

1st PCRのサイクル数を上げすぎると非特異的な増幅(ネガティブコントロールでも増幅してしまう)が
起こってしまう可能性がございます。

各遺伝子のPCR条件詳細については下記でダウンロード可能です。

16SrRNA V4

16SrRNA V1V2

16SrRNA V3V4

ITS1(ITS1F_KYO1-ITS2_KYO2)

ITS2(gITS-ITS4)

18S(真核生物)

MiFish(環境DNA/魚類)

COI

COI(ブロッキング有)

PCR産物の精製について

2ndPCRに用いるプライマーはMiSeqでの解析(SBS法)に必要な配列を含んでおります。MiSeqでの解析時に2ndPCRに用いるプライマーが含まれていると、2ndPCR用プライマーが優先的に解析されてしまい、データの取得が困難となってしまう可能性がございます。
PCR産物精製で最も重要なのはプライマーの除去です。

弊社ではビーズ精製を行っています(Agencourt AMPure XP を使用)。
カラム精製でも問題ないと判断しておりますが、経験上ビーズ精製を推奨しております。

<送付いただきましたサンプルについて>

お客様からお預かりいたしましたサンプルについては、全て bioanalyzer(またはFlagment analyzer) と Qubit での品質検定と濃度測定を行います。測定の結果、プライマーの混入等の解析対象以外のピークが確認され、MiSeqでの解析に問題があると判断した場合、弊社でビーズ精製を行います(有償:5,000円)。
また、場合によっては解析を中止させていただく場合もございます。

次世代シーケンス解析

サンガー法によるDNA解析

次世代シーケンスデータのDDBJへの登録について 遺伝子解析サービスについて

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