●プライマー配列(5’→3’)/アンプリコンシーケンス解析(illumina MiSeq)用
1st_PCR_515F_MIX:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNN–GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
1st_PCR_806RB_MIX:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNN–GGACTACNVGGGTWTCTAAT
細字:アダプター配列(2nd PCR用のプライマーとの相同部分)
赤字 N:シーケンス解析時における品質向上を目的として、0-5塩基の異なる長さのランダム配列が挿入された混合プライマーです
太字:16S rRNA との相同配列
●参考文献
Apprill et al. Aquat. Microb. Ecol. (2015) 75:129-137
●1stPCR後の増幅長
約370 bp
1stPCRの反応組成と反応条件例
以下は、 PCR 酵素に ExTaq HS [TaKaRa]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。
●反応組成
- 10x Ex buffer
- 2.0 ul
- dNTPs (each 2.5 mM)
- 1.6 ul
- 10 uM Forward primer
- 1.0 ul
- 10 uM Reverse primer
- 1.0 ul
- Template DNA (1ng)
- 1.0ul
- ExTaq HS[TaKaRa](5 U/ul)
- 0.2 ul
- 滅菌蒸留水
- 13.2 ul
- Total
- 20 ul
●反応温度
- 94°C
- 2min
- 94°C
- 30sec|
- 50°C
- 30sec|25-35 cycles
- 72°C
- 30sec|
- 72°C
- 5min