16S rRNA V4領域(ver2):515F-806RB プライマー情報

●プライマー配列(5’→3’)/アンプリコンシーケンス解析(illumina MiSeq)用
1st_PCR_515F_MIX:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNGTGCCAGCMGCCGCGGTAA
1st_PCR_806RB_MIX:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNGGACTACNVGGGTWTCTAAT

細字:アダプター配列(2nd PCR用のプライマーとの相同部分)
赤字 N:シーケンス解析時における品質向上を目的として、0-5塩基の異なる長さのランダム配列が挿入された混合プライマーです
太字:16S rRNA との相同配列

●参考文献
Apprill et al. Aquat. Microb. Ecol. (2015) 75:129-137
515F-806Rの改良版です。海洋表層中の自由生活性細菌であるSAR11クレードのDNAを検出されやすく改変されました。

●1stPCR後の増幅長
約370 bp

1stPCRの反応組成と反応条件例

以下は、 PCR 酵素に ExTaq HS [TaKaRa]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。

●反応組成

10x Ex buffer
2.0 ul
dNTPs (each 2.5 mM)
1.6 ul
10 uM Forward primer
1.0 ul
10 uM Reverse primer
1.0 ul
Template DNA (1ng)
1.0ul
ExTaq HS[TaKaRa](5 U/ul)
0.2 ul
滅菌蒸留水
13.2 ul
Total
20 ul

 

●反応温度

94°C
2min
94°C
30sec|
50°C
30sec|25-35 cycles
72°C
30sec|
72°C
5min

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