●プライマー配列(5’→3’)/アンプリコンシーケンス解析(illumina MiSeq)用
V8f:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-ATAACAGGTCTGTGATGCCCT
1510r:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
細字:アダプター配列(2nd PCR用のプライマーとの相同部分)
太字:18S との相同配列
●参考文献
Bradley, I. M., Pinto, A. J., & Guest, J. S. (2016).
Design and evaluation of Illumina MiSeq-compatible, 18S rRNA
gene-specific primers for improved characterization of mixed
phototrophic communities. Applied and environmental microbiology, 82(19),
5878-5891.
●1stPCR後の増幅長
約450 bp
1stPCRの反応組成と反応条件例
以下は、 PCR 酵素に KOD FX Neo [TOYOBO]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。
●反応組成
- 2× PCR Buffer for KOD FX Neo
- 10.0 ul
- dNTPs (each 2 mM)
- 4.0 ul
- 10 uM Forward primer
- 0.4 ul
- 10 uM Reverse primer
- 0.4 ul
- Template DNA (0.5 ng)
- 2.0ul
- KOD FX Neo (1.0 U/uL)[TOYOBO]
- 0.4 ul
- Nuclease-Free Water
- 2.8 ul
- Total
- 20.0 ul
●反応温度
- 94°C
- 2min
- 98°C
- 10sec|
- 53°C
- 30sec|25-35 cycles
- 68°C
- 30sec|
- 68°C
- 7min