Iso-seq解析(ロングリードRNA-seq解析・PacBio社)

2022年10月1日開始!

1.Iso-seq解析(ロングリードRNA-seq解析・PacBio Sequel lle)サービス概要

対象生物 真核生物のみ。
cDNA合成にoligo dTを用いているので、polyAを持たない生物はLib調製できず解析不可となります。
価格(税別) 1セル占有プラン 700,000円
※1サンプル分のライブラリー調製費用は上記に含まれています。複数サンプルご依頼の場合は、2サンプル目以降からライブラリー調製費用80,000円/サンプルが別途必要です。
納期 30営業日
※3セル以上の場合は要相談
データ量 1セルで200万リード程度(サンプルに依存するため、データ保証はできません)。
通常得られるIsoformの数は全遺伝子数の2-5倍と言われていますので、取得データ量は遺伝子数の10倍が目安です。遺伝子数に応じて複数セルでのシーケンシングが必要になります。
作業内容 ・送付サンプル(トータルRNA)の品質確認
・オリゴdTプライマーでcDNA合成
・シーケンスライブラリー作製
・シーケンシング解析(PacBio Sequel lle Iso-seq解析)
・データ解析
リードの振り分けおよびIndex配列の除去を行った後、完全長リードのノイズを除去します。Iso-Seq3を用いて、フィルタリングした完全長リードをクラスタリングします。
その後、参照配列がある場合は、pbmm2を用いてクラスタリングしたhq.fastaを参照配列にマッピングを行います。Iso-Seq3を用いて、固有のアイソフォームに分類します。参照gtfもある場合は、SQANTI3を用いて、統合したアイソフォームをアノテーションします。
納品物  以下のデータをDVDやUSB等の記録媒体に保存して納品します。
・シーケンス生データ(fastq&bam形式)
・クラスタリングの結果 (エクセルファイルとfasta形式)
・DDBJのデータベース登録に必要なデータ
—– 参照配列がなければ納品物はここまで —–
・固有のアイソフォームの分類データ(gff形式など)
・Mappingの結果(bam形式)
・参照配列(fasta&fasta.fai形式)
—– 参照配列があるが、参照gtfがなければ納品物はここまで —–
・Annotation結果(エクセルファイル)
・参照遺伝子アノテーション(gtf形式)
—– 参照配列とgtfともがあれば納品物はここまで —–
ご提供
サンプル
トータルRNA 1 μg以上/1セル(>50ng/ul、>20ul)
※RNase-free waterに溶解した状態で冷凍便を使用して送付ください。
ご依頼の流れ まずはお問合せフォームからお見積りをご依頼ください。

 

2.オプション

項目 備考 価格(税別) 追加
納期
RNA抽出 QIAGEN社のRNeasy等を使用して、トータルRNAを抽出します。
<ご提供サンプル量の目安>
酵母:細胞数 5×10^7程度、湿重量 25 mg程度
植物(葉):湿重量 50 mg程度、直径1.5cm
動物細胞:細胞数 1×10^7程度、湿重量 20 mg程度
動物組織:湿重量 20 mg程度
20,000円/サンプル 5営業日

ータ解析
発現比較解析 iDEGES正規化(Sun et al., BMC Bioinformatics, 2013)後、edgeR/DESeqを用いて発現変動遺伝子を検出致します。 1パターン50,000円
※追加1パターンごと+10,000円
なし
Volcano プロット 発現比較解析結果の発現比とp値で作図します。 1パターン10,000円
※追加1パターンごと+2,000円
なし
ベン図 複数の発現比較解析の結果、発現上昇または低下した遺伝子の集合関係をベン図で示します。
ベン図についてのご説明
20,000円 なし
主成分分析(PCA) 遺伝子発現プロファイルの類似性を座標分布で示します。 10,000円 なし
クラスタリング解析 遺伝子発現プロファイルの類似性を階層クラスタリングで示します。 10,000円 なし
相関図作成 遺伝子発現プロファイルの類似性を相関図で示します。 10,000円 なし
ヒートマップ解析 遺伝子発現プロファイルを色で表現した可視化グラフを作成できます。 20,000円 なし
パスウェイ解析 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)を利用したパスウェイ解析です。発現変動解析の結果から同定された遺伝子が、どのような代謝系に関わっているのかを可視化させます。 1パターン50,000円
※追加1パターンごと+10,000円
なし
Gene Ontology (GO) 解析 全遺伝子のGO termと発現比較解析の結果から同定された発現変動遺伝子のGO termについて、出現頻度の比較とFisher検定による有意差検定を行います。発現変動遺伝子の特徴的なGO termを推定することができます。 1パターン50,000円
※追加1パターンごと+10,000円
なし
→パスウェイ解析&GO解析 セット割引 -30,000円

3.具体例

標準解析

エクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます(参照配列とgtfがある場合の納品データ例です)

isoseq

発現変動解析(オプション)

1.遺伝子発現比較解析の結果をエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます

===データの見方===
-sample_name: 正規化前のリードカウント
– a.value: log2(平均発現量)
– m.value: log2(発現比)
– p.value: p値
– q.value: q値 (false discovery rate(FDR))
– rank: q値が低い順にランク付けされています。
– estmatedDEG: 「1」は発現変動遺伝子(q<0.05)、「0」は発現変動遺伝子ではないこと(q>0.05)を示します。

2.MAプロットの図をpng形式で納品します。
横軸がlog2(平均発現量(A))、縦軸がlog2(発現比(M))を示しています。
MAplot

Volcano プロット

Volcano プロットをpng形式で納品します。
Volcano プロット は、MAプロットの親戚の図です。volcano plotは横軸がlog2(発現比)、縦軸がp値を示しています。

主成分分析(オプション)

1.相関行列をエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます

correlation

2.主成分分析の結果をpng形式で納品します。
PCoA RNAseq

クラスタリング解析(オプション)

クラスタリングの結果をpng形式で納品します。
clustering

ヒートマップ解析(オプション)

Treeview用のデータを納品します。
そのデータを使用して、お客様自身でご希望のヒートマップ図を作成いただけます。
Heatmap RNAseq

パスウェイ解析(オプション)

パスウェイ解析の結果をテキストデータで納品します。エクセルで開くことができます。>>詳しいデータをご覧いただけます

KEGG

Gene Ontology(GO)解析

Gene Ontology(GO)解析の結果をエクセルデータで納品します。

GO解析結果例

4.よくある質問

Q1.推奨のRNA抽出キットは?

特にございません。弊社ではQIAGEN社のRNeasyシリーズを使用することが多いです。

Q2.送付の際、バッファーは何でもよい?

滅菌水のほか、Tris や TE 、抽出キットの溶出バッファーでも構いません。但し、塩濃度が高いバッファーの場合、QCの電気泳動がうまくいかない可能性がありますので、避けてください。

Q3.RIN値の目安は?

バイオアナライザーのRIN値で7以上が目安です。送付前にお客様側でも品質確認される際は、参考にしてください。

Q4.DNase処理は必要?

ゲノムDNAの混入は望ましくないので、DNase処理をお勧めします。

Q5.送付時の温度帯は?

●total RNA送付の場合
冷凍便を利用し、必ずドライアイスを同梱してください。

●生サンプル送付(弊社にRNA抽出もご依頼)の場合
◇RNAlaterなどの核酸保存液に浸しているサンプル
冷凍便を利用し、ドライアイスは同梱せずに送付してください(核酸保存液は-20℃以下で凍結してしまうため)。
◇-80℃で保存していたサンプル
冷凍便を利用し、必ずドライアイスを同梱してください。

Q6.オプションのデータ解析は必要?

必要かどうかは目的によります。
オプションを付けない標準のRNA-seq解析でも遺伝子の発現量やざっくりとした遺伝子発現の違いは明らかにできます。
それが統計的に有意かどうか解析する場合に「発現比較解析」が必要になります。
「発現比較解析」は発現量に有意差のある遺伝子(発現変動遺伝子)をリストアップするだけですので、同定された発現変動遺伝子の代謝系における役割や機能的グループを明らかにしたい場合は、それぞれ「パスウェイ解析」や「GO解析」を行う必要がある、といった使い分けになります。「パスウェイ解析」では発現変動遺伝子が代謝系のどの部分が変動しているのかが分かり、「GO解析」では発現変動遺伝子がどのような機能をもったグループが多いかが分かります(出現頻度の解析)。

Q7.発現比較解析などのパターン数って?

例えば、A群・B群・C群があり、A群 VS B群・A群 VS C群の発現比較解析をする場合は2パターン、総当たりで行う場合は3パターンとなります。3群間比較(A群 VS B群 VS C群)も可能ですが、発現比較の発現平均値(A値)と発現比(M値)が算出されないため、MAプロット図の納品はなく、エクセルデータのみの納品となります。

5.お問合せ・サンプル送付先

お見積り・お問合せ

お問合せフォーム、メール(dna@gikenbio.com)、または お電話(042-780-8333)でお気軽にご相談ください。

サンプル送付先

株式会社生物技研
〒252-0154 神奈川県相模原市緑区長竹657 / TEL 042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。

<添付書類>
依頼書→dna@gikenbio.comへ送信ください。あわせてサンプル送付時に印刷したものを同封ください。

 

 

遺伝子解析サービスについて

DDBJへの登録について

新しい試み