アンプリコンシーケンス解析

アンプリコンシーケンス解析

納品物 DVDなどの記録媒体にて納品
<データ内容>
・報告書
・シーケンスデータ
・QIIMEによる系統解析結果
→エクセルファイルと解析結果を可視化したバーグラフとヒートマップ、サンバーストチャート(htmlファイル)
※一部の遺伝子領域(12SrRNAやCOIなど)は、「エクセルデータ」のみになります。
・DDBJのデータベース登録に必要なデータ
納品データのサンプル
ヒトの腸内細菌叢の解析結果です。多様性解析(オプション)のデータも含まれています。
(解析領域は16SrRNAのV3/V4領域)
データ量 ライブラリーの品質が良い場合(両端にアダプターがきちんと付加されている)、経験的に8サンプルで40万リード程度は得られます。

 

※価格は税別

1.アンプリコンシーケンス解析料金早見表

サンプル数 試料を送るだけ! 抽出したDNAを送る 1stPCR産物を送る
1 30,000円 20,000円
8 137,000円 105,000円 80,000円+1,500円*
16 274,000円 210,000円 160,000円+1,500円*
24 411,000円 315,000円 240,000円+1,500円*
32 548,000円 420,000円 320,000円+1,500円*
40 ↓下記参照 ↓下記参照 400,000円+1,500円*

* ライブラリー作製用プライマー代(送料込み)です。

アンプリコンシーケンス解析料金早見表
※MiSeq300bpペアエンド解析 共有20%で、通常300-400万リードが得られます。
* ライブラリー作製用プライマー代(送料込み)です。
納期はサンプル数に関係なく、20営業日です。

 

オプション料金表
項目 価格(税別)
液体サンプルのフィルターろ過(1サンプル) 4,000円
PCR阻害物質の除去 10,000円/8サンプル
1stPCR 4反復 16,000円/8サンプル
ライブラリーのビーズ精製(注1) 5,000円/8サンプル
ブロッキング こちらをご覧ください
残サンプルの返却 ※送料込 1,500円
QIIME2.0使用 0円
EzBioCloud 16S database使用 20,000円
多様性解析(納品後(注1)) 10,000円(30,000円)
機能予測解析(バクテリアのみ可能) 50,000円
(注1) 送付いただいたライブラリーが精製不足の場合、弊社で再精製を行います。
(注2) 一度納品させていただいたデータの中からご指定いただいたサンプルを、Qiimeを用いて再解析を行い、レアファクション解析と主座標分析(PCoA)を行なうサービス です。複数のご注文にわたってサンプルをご指定いただくことが可能です。

 

2.アンプリコンシーケンス解析の流れ

試料を送るだけ!
137,000円/8サンプル
納期:20営業日
抽出したDNAを送る
105,000円/8サンプル
納期:20営業日
1stPCR産物を送る
80,000円/8サンプル
納期:20営業日
サンプリング (お客様)
弊社提供の専用1.5mlチューブに試料を入れ、冷凍便で送付してください(注3)
DNA抽出
糞便や土壌、水など様々なサンプルからの抽出実績があり、それぞれのサンプルに最適な抽出方法で行います。
(お客様)
抽出したDNAを冷蔵便で送付してください。濃度5ng/μl、液量20μl 以上でお願いします。
ライブラリー作製
PCR反応と精製を2回行い、ライブラリーを作製します。
ご希望の遺伝子領域を増幅するためのライブラリー作製用プライマーは1,500円(送料込)でご提供致します。
(お客様)
弊社提供のプライマーを用いて増幅した1stPCR産物(精製不要)を、冷蔵便で送付してください。液量15μl 以上でお願いします。⇒サンプル調製方法の詳細はこちら

(1stPCR産物の精製から)
ライブラリーの定量
蛍光法による2本鎖DNAの定量とフラグメントアナライザーによるピークの確認を行います。
シーケンス解析
MiSeqで300bpペアエンド解析を行います(他のお客様との相乗り)。8サンプルあたり40万リード程度を取得します。
データ解析
菌叢解析用パイプライン「Qiime」を用いて解析を行い、「菌群組成グラフ」や 「ヒートマップ」、「サンバーストチャート」の形でデータの可視化まで行います。一部の遺伝子領域(12SrRNAやCOIなど)は、「エクセルデータ」のみを提供いたします。
サービスアップ
①QIIME2.0に変更可(ご依頼時にご指示ください/追加料金不要)②EzBioCloud 16S database 使用に変更可(追加料金20,000円)
多様性解析(注4)
レアファクション解析(chao1やshannonなど)と主座標分析 (PCoA)の結果を提供いたします。
オプション オプション オプション
機能予測解析
検出しているバクテリアがコードしている遺伝子をKEGG情報に基づき、機能的分類・カウントし、さらにそれを検体ごとに比較します。
オプション オプション オプション
(注3) 弊社からご提供させていただく専用チューブに入れて発送いただきます。サンプルの形状等により弊社で追加の作業が必要と判断した場合は別途料金をいただきます。また、サンプルの内容(例えば感染性の有無)によりお断りする場合がございます。
DNA 抽出は、対象生物やサンプルの状況によって抽出方法を最適化する必要がございます。より良いデータを得るための非常に重要なステップであると位置づけております。この観点から弊社におけるDNA抽出ノウハウに乏しいサンプルについてはお断りさせていただく場合がございます。
(注4) 一部の遺伝子領域において、多様性解析が行えない場合がございます。

 

対象遺伝子領域
ターゲット生物種 対象領域 データ解析方法
細菌と古細菌 16S rRNA V4領域:515F-806R QIIME解析(可視化データを納品)
細菌 16S rRNA V3/V4領域:V3V4f-V3V4r
16S rRNA V1/V2領域:27Fmod-338R
真菌類 ITS1領域:ITS1F_KYO1 – ITS2_KYO2
(植物由来DNAは増幅しにくい)
ITS2領域:gITS7 – ITS4
(真菌類を広くカバーしているが、植物由来DNAが増幅する)
ITS2領域:fITS7 – ITS4
(gITSほど真菌類を広くカバーしていないが、植物由来DNAは増幅しにくい)
真核生物 18S rRNA
動物 Cytochrome oxidase subunit I (COI) USEARCH解析(エクセルデータを納品)
魚類 12S rRNA (MiFish)
哺乳類(※1) 12S rRNA (MiMammal)
節足動物(※2) 16S rRNA (Insect)
鳥類(※2) 16S rRNA (Bird)
有尾類(イモリ類とサンショウウオ類)(※2) 16S rRNA (Salamander)
線虫(※2) 18S rRNA (Ecdysozoa)
陸上植物(※2) rbcL
光合成生物(主に単細胞生物)(※2) psbA
カスタム 任意の領域 (おおよそ500bp以下)
※個別対応させていただきます。
※領域による

※1 弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。
※2 自社で開発したプライマーでの解析です。

 

3.アンプリコンシーケンス解析の具体例

【16S rRNAやITS領域, 18S rRNAの場合】
◆実験概略

糞便をサンプルとした腸内細菌相解析
目的:DNA抽出を行う前の粉砕方法の違いによって菌叢が変化するかの検証
方法:以下の3条件の前処理を3反復で行った。また、DNA抽出キットはMP bio社のFastDNASpinを用いた。
・粉砕せず
・液相での粉砕(FastDNASpinのプロトコルどおり)
・凍結乾燥を行い、5mmステンレスビーズで破砕
解析遺伝子:16SrRNA V3/V4領域

サンプル名 処理 DNA抽出の結果(ug)※
no treatment-1 未粉砕 1.9
no treatment-2 未粉砕 1.2
no treatment-3 未粉砕 1.6
liquid grinding-1 液相粉砕 2.9
liquid grinding-2 液相粉砕 3.9
liquid grinding-3 液相粉砕 3.2
dry grinding-1 凍結乾燥粉砕 25.3
dry grinding-2 凍結乾燥粉砕 23.6
dry grinding-3 凍結乾燥粉砕 20.9

※サンプリング量を厳密に同じにしてはいません。

菌相組成の棒グラフ  >>詳しいデータをご覧いただけます。
菌相組成グラフ
OTU heatmap  >>詳しいデータをご覧いただけます。
OTUheatmap
サンバーストチャート  >>詳しいデータをご覧いただけます。
サンバーストチャート
レアファクション解析(オプション) >>詳しいデータをご覧いただけます。
レアファクションカーブ
主座標分析(オプション) >>詳しいデータをご覧いただけます。
主座標分析

 

機能予測解析(オプション) >>詳しいデータをご覧いただけます 納品データのサンプル
※上記実験概略とは別実験のサンプルデータです。
【12S rRNAやCOIの場合】
各OTUに対して、検出されたリード数と対応する生物種を示した「エクセルデータ」を提供致します。また、データベースの配列と98%以上の相同性があったOTUのみ相同性トップ10まで和名を明記致します。

●例1)12S rRNA(MiFish)  >>詳しいデータをご覧いただけます。
相模川魚類相解析データサンプル

●例2)12S rRNA(MiMammal)  >>詳しいデータをご覧いただけます。
哺乳類解析結果

●例3)16S rRNA(Insect)  >>詳しいデータをご覧いただけます。
節足動物相解析データ

●例4)COI  >>詳しいデータをご覧いただけます。
COI

 

 

EzBioCloud 16S database使用

使用データベースによる系統推定結果の比較デモデータ

●アンプリコンシーケンス解析関連ページ

アンプリコンシーケンス解析のパンフレットPDF

次世代シーケンス解析

生物種の同定

次世代シーケンスデータのDDBJへの登録について 遺伝子解析サービスについて

なんでもかんでもアンプリコンシーケンス

  1. 味噌
  2. 口腔内細菌相解析
  3. キムチ

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