<アンプリコンシーケンス解析>サンプル調製について

<アンプリコンシーケンス解析>サンプル調製について

弊社ではアンプリコン調製に2段階PCRを用いております。
1stPCRでは、増幅対象遺伝子と相補鎖を形成する配列+MiSeqでの解析に必要な共通配列の一部を含んだプライマーを用います。2ndPCRでは、MiSeqでの解析に必要な共通配列とサンプル識別を行う為のMID配列でデザインされたプライマーを用います。

例)16S rRNA V4領域をターゲットとした1st PCR用のプライマー配列

プライマー名 配列(5’→3’)
 1st_PCR_515F  ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
 1st_PCR_806R  GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-GGACTACHVGGGTWTCTAAT

※「-」で区切られた前半部分が2nd PCR用のプライマーとの相同部分、後半が16SrRNAとの相同部分です。

弊社でのMiSeq利用をご検討しておられ、お客様でライブラリー調製を行われる場合は、弊社よりプライマーを送付いたします。
1stPCR用プライマーは1,500円(税別・送料込)、
1stPCR用&2ndPCR用プライマーは10,000円/96サンプル(税別・送料込)です。

アンプリコンシーケンス解析の「5.対象遺伝子領域」のプライマーセットはストックがありますので、すぐにご提供可能です。
また、リストにないプライマーセットでの解析も可能です。遺伝子特異的部分のプライマー配列を教えていただければ、1stPCR用プライマーを合成してお送りします。合成は無償で、送付代として上記の通り1,500円(税別)がかかります。

サンプル調製の詳しい情報については、以下をご確認ください。

テンプレートDNAについて

経験上1~5ng程度のDNA量を推奨しております。
また、DNA抽出については市販のDNA抽出キットをご利用していただければ問題ございません。
抽出キットとの比較検証データはこちら

PCRの条件について(各遺伝子ごとの詳細プロトコルがダウンロード可能)

1st PCRのサイクル数を上げすぎると非特異的な増幅(ネガティブコントロールでも増幅してしまう)が
起こってしまう可能性がございます。

各遺伝子のPCR条件詳細については下記でダウンロード可能です。

16SrRNA V4 16SrRNA V1V2 16SrRNA V3V4

ITS1(ITS1F_KYO1-ITS2_KYO2) ITS2(gITS-ITS4)

18S(真核生物) MiFish(環境DNA/魚類) COI COI(ブロッキング有)

PCR産物の精製について

2ndPCRに用いるプライマーはMiSeqでの解析(SBS法)に必要な配列を含んでおります。MiSeqでの解析時に2ndPCRに用いるプライマーが含まれていると、2ndPCR用プライマーが優先的に解析されてしまい、データの取得が困難となってしまう可能性がございます。
PCR産物精製で最も重要なのはプライマーの除去です。

弊社ではビーズ精製を行っています(Agencourt AMPure XP を使用)。
カラム精製でも問題ないと判断しておりますが、経験上ビーズ精製を推奨しております。