12S rRNA (MiMammal) プライマー情報

●プライマー配列(5’→3’)/アンプリコンシーケンス解析(illumina MiSeq)用
1st-MiMammal UEB mix F:
①ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNGGGTTGGTAAATTTCGTGCCAGC
②ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNGGACTGGTCAATTTCGTGCCAGC
③ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNNGGGTTGGTTAATTTCGTGCCAGC
1st-MiMammal UEB mix R
①GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
②GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNNCATAGTGAGGTATCTAATCTCAGTTTG
③GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG
※それぞれ①:②:③=1:1:1で混合したプライマーです。

細字:アダプター配列(2nd PCR用のプライマーとの相同部分)
赤字 N:シーケンス解析時における品質向上を目的として、1-6塩基の異なる長さのランダム配列が挿入された混合プライマーです
太字:12S rRNA との相同配列

●参考文献
Ushio et al.2016

●1stPCR後の増幅長
約290-310 bp

1stPCRの反応組成と反応条件例

以下は、 PCR 酵素に ExTaq HS [TaKaRa]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。

●反応組成

10x Ex buffer
2.0 ul
dNTPs (each 2.5 mM)
1.6 ul
10 uM Forward primer
1.0 ul
10 uM Reverse primer
1.0 ul
Template DNA (2 ng)
4.0ul
ExTaq HS[TaKaRa](5 U/ul)
0.15 ul
滅菌蒸留水
10.25 ul
Total
20.0 ul

 

●反応温度

94°C
2min
94°C
20sec|
65°C
15sec|35 cycles
72°C
20sec|
72°C
5min

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