RNA-seq解析（遺伝子発現解析）

1. サービス概要
価格	40,000円/サンプル
データ量	2,000万リード/3Gb（サンプルがバクテリア等の場合は、1,000万リード/1.5Gb）
納期	4～6週間
作業内容	・送付サンプル（トータルRNA）の品質確認（注1）・オリゴdTでmRNAを精製、ランダムプライマーでcDNA合成・シーケンスライブラリー作製　※サンプルがバクテリアの場合、rRNA除去が必須です（20,000円/サンプル）・シーケンシング解析（DNBSEQ-G400 150bpペアエンド解析）・データ解析（注2） hisat2ソフトウェアを用いて参照配列にマッピングいたします。その後、featureCountを用いてカウントを行った後、RPKM正規化を行います。 ※cufflinksを用いた解析も対応可能です。
ご提供サンプル	トータルRNA 1 μg以上（＞50ng/ul、＞20ul） ※滅菌水に溶解した状態で冷凍便を使用して送付ください。 ※1μg以上のトータルRNAがご用意できない場合は、ご相談ください。
ご提供情報	1.サンプル情報提供用紙→サンプル送付時に同封ください 2.オーダーシート→dna@gikenbio.comへ送信ください 3. データ解析依頼書→　〃レファレンス配列(fasta形式)/遺伝子アノテーション情報（gff形式, gtf形式）はCD-RやUSBに入れて送付頂くか、ダウンロードできるURLをご連絡下さい。 De novo transcriptome assemblyの解析をご希望のお客様は、お送り頂かなくても結構です。

（注1）rRNAの分解が進んでおり、シーケンシング解析を行ってもデータが得られないと判断した場合は、中止させていただきます（この場合のご請求は行いません）。
（注2）De novo transcriptome assembly 解析の場合、解析方法が通常の解析とは異なります。

2. オプション
項目		備考	価格（税別）	追加納期
RNA抽出		QIAGEN社のRNeasy等を使用して、トータルRNAを抽出します。	20,000円/サンプル	1週間
rRNA除去		siTOOLs Biotech社のriboPOOLを使用して、rRNAを除去します。	20,000円/サンプル	なし
データ解析	発現比較解析	<参照ゲノム配列あり> iDEGES正規化（Sun et al., BMC Bioinformatics, 2013）後、edgeRを用いて発現変動遺伝子を検出致します。	1パターン50,000円 ※追加1パターンごと＋10,000円	なし
	発現比較解析	<参照ゲノム配列なし> De novo transcriptome assemblyで得られたcontigに対しRSEMを用いてマッピングを行います。その後、edgeRを用いて発現変動遺伝子を検出致します。	1パターン50,000円 ※追加1パターンごと＋10,000円	なし
	主成分分析（PCA)	遺伝子発現プロファイルの類似性を座標分布で示します。	10,000円	なし
	クラスタリング解析	遺伝子発現プロファイルの類似性を階層クラスタリングで示します。	10,000円	なし
	ヒートマップ解析	遺伝子発現プロファイルを色で表現した可視化グラフを提供します。	20,000円	なし
	パスウェイ解析	KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）を利用したパスウェイ解析です。発現変動解析の結果から同定された遺伝子が、どのような代謝系に関わっているのかを可視化させます。	1パターン70,000円 ※追加1パターンごと＋10,000円	なし
	Gene Ontology (GO) 解析	全遺伝子のGO termと発現比較解析の結果から同定された発現変動遺伝子のGO termについて、出現頻度の比較とFisher検定による有意差検定を行います。発現変動遺伝子の特徴的なGO termを推定することができます。	1パターン70,000円 ※追加1パターンごと＋10,000円	1週間
	→パスウェイ解析＆GO解析　セット割引　-40,000円
	De novo transcriptome assembly	参照配列がない非モデル生物の遺伝子カタログ作成を、Trinityを用いて行います。	100,000円	なし

3.RNA-seq解析（発現解析）の具体例

標準解析

遺伝子発現行列データをエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます。
サンプル毎にどの遺伝子に何リードマッピングされたかを示しています。また、RPKM正規化後の数値も示しています。
count

発現変動解析（オプション）

1.遺伝子発現比較解析の結果をエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます。

===データの見方===
-sample_name: 正規化前のリードカウント
– a.value: log2(平均発現量)
– m.value: log2(発現比)
– p.value: p値
– q.value: q値 (false discovery rate(FDR))
– rank: q値が低い順にランク付けされています。
– estmatedDEG: 「1」は発現変動遺伝子(q<0.05)、「0」は発現変動遺伝子ではないこと(q>0.05)を示します。2.MAプロットの図をpng形式で納品します。
MAplot

横軸がlog2(平均発現量(A))、縦軸がlog2(発現比(M))を示しています。

主座標分析（オプション）

1.相関行列をエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます。
correlation

2.主座標分析の結果をpng形式で納品します。
PCoA　RNAseq

ヒートマップ解析（オプション）

ヒートマップの図をpng形式で納品します。
Heatmap RNAseq

クラスタリング解析（オプション）

クラスタリングの結果をpng形式で納品します。
clustering

パスウェイ解析（オプション）

パスウェイ解析の結果をテキストデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます。 KEGG

エクセルで開くことができます。

4. よくある質問

Q1.推奨のRNA抽出キットは？
A1.特にございません。弊社ではQIAGEN社のRNeasyシリーズを使用することが多いです。

Q2.送付の際、バッファーは何でもよい？
A2.滅菌水のほか、Tris や TE 、抽出キットの溶出バッファーでも構いません。但し、塩濃度が高いバッファーの場合、QCの電気泳動がうまくいかない可能性がありますので、避けてください。

Q3.RIN値の目安は？
A3.バイオアナライザーのRIN値で7以上が目安です。送付前にお客様側でも品質確認される際は、参考にしてください。

Q4.発現比較解析などのパターン数って？
A4.例えば、A群・B群・C群があり、A群 VS B群・A群 VS C群の発現比較解析をする場合は2パターン、総当たりで行う場合は3パターンとなります。3群間比較（A群 VS B群 VS C群）も可能ですが、発現比較の発現平均値（A値）と発現比（M値）が算出されないため、MAプロット図の納品はなく、エクセルデータのみの納品となります。

Q5.DNBSEQってどうなの？
A5.DNBSEQについてのよくあるご質問はこちらをご覧ください。