GRAS-Di®技術による解析・MIG-seq解析・RAD-seq解析

塩基多型を検出し、得られたSNPマーカーを用いて、系統解析や連鎖地図作成、QTLマッピングを行います。
解析内容（目的や対象生物、サンプル数など）をお知らせください。最適なプランをご提案いたします。

GRAS-Di®とは？
グラスディーアイと読み、トヨタ自動車株式会社が開発した技術です。
ランダムプライマーを用いてPCRすることにより、ゲノムの複数個所を増幅します。ゲノムワイドに増幅されたアンプリコンを次世代シーケンサーで解析した後、同社が独自開発したソフトウエアでジェノタイピング解析を行います。得られる解析結果は、アンプリコン増幅の再現性が高く、ジェノタイプデータの欠損が少ないのが特徴です。
※GRAS-Di®はトヨタ自動車株式会社の登録商標です。

1.GRAS-Di®解析・MIG-seq解析・RAD-seq解析の流れ

		RAD-seq解析	GRAS-Di®解析	MIG-seq解析
（お客様） サンプルと情報のご提供		ゲノムDNA(注1) >10ng/µl, >20µl	ゲノムDNA(注1) >15ng/µl, >20µl	ゲノムDNA(注1) >1ng/µl, >20µl
		・冷蔵便または冷凍便で（株）生物技研へ送付ください。 8連チューブまたはプレートでお願いします。 ・GRAS-Di解析の場合は、DNA濃度測定の際のブランク用に溶出バッファーを100 ul程度サンプルと一緒にご送付ください（難しければ、バッファーの情報の提供をお願いします）。 ・サンプル送付時に、当社指定の依頼書をご提出ください。依頼書はお見積時に添付します。
↓
ライブラリー作製		ddRAD法を用いてライブラリーを作製します。使用する制限酵素はMspIと EcoRIの組み合わせですが、別の制限酵素からお選び頂くことも可能です。	トヨタ自動車株式会社のプロトコールに従い、ライブラリーを作製します。 ①と②の２通りの方法があります。 ①DNBSEQのアダプター配列を付加したプライマーを用います。（注2） ②イルミナ社のアダプター配列を付加したプライマーを用います。（注2・注3）	Suyama et al., 2021. と同様の方法を用いて、ライブラリーを作製します。
↓
シーケンス解析		DNBSEQ　150bpペアエンド 1サンプルあたり100万リード程度	DNBSEQ　150bpペアエンド 1サンプルあたり100万リード程度	DNBSEQ　150bpペアエンド 1サンプルあたり100万リード程度
↓
データ解析 目的に合わせいずれかの解析を行います（価格は税別）	GRAS-Di®解析ソフトウェアによる解析（10万円）		〇
	ジェノタイピング解析 （8万円）	〇	〇	〇
	┣ ＋系統解析 （2万円）	〇	〇	〇
	┣ ＋structure解析 （2万円）	〇	〇	〇
	┗ ＋遺伝的指数の算出 （2万円）	〇	〇	〇
	連鎖地図作成 （20万円）	〇	〇
	QTLマッピング （20万円）	〇	〇

(注1)　試料を送付いただき、弊社でDNA抽出を行うことも可能です（DNA抽出費用24,000円/8サンプル、納期5営業日追加）。
(注2)　弊社の試験では、①と②では異なる部位がシーケンシングされることがわかりました。継続的な解析の場合、以前と同一メーカーのアダプターを付加したプライマーを用いる方法をご選択ください。
(注3)　②は、リン酸化されたプライマーで2ndPCRを行った後、環状化させてDNBSEQでシーケンス解析します。イルミナ社シーケンサーでシーケンス解析した場合と同等の結果が得られることを検証済です。

＜データ解析の内容＞

GRAS-Di®解析ソフトウェアによる解析	GRAS-Di®解析ソフトウェアを用いて、アンプリコンごとのリード数やその配列、増幅断片のサイズ、遺伝子型などをExcelファイルで納品します。
ジェノタイピング解析	Stacksを用いてde novoアセンブルを行います。アセンブルされたカタログ配列に対し、各サンプルをジェノタイプします。
┣ 系統解析	RAxML（GTR+gammaモデル）を用いた最尤法により系統樹を作成します。
┣ structure解析	structureを使用して集団の遺伝的構成の違いを可視化します。
┗遺伝的指数の算出	ジェノタイピング解析で得られたSNPデータと指定のグループ分け情報を使用し、Stacksで集団内と集団間（総当たり）の遺伝的指数（ヘテロ接合度の観察値と期待値、塩基多様度、近交係数、固定指数）を算出します。
連鎖地図作成	Bowtieを用いてレファレンスにリードをマップした後、samtoolsとbcftoolsを用いて、SNPを検出致します。その後、vcftoolsを用いてSNPのフィルタリングを行います。遺伝子型データをもとにJoinmapを使用して、連鎖地図を作成致します。
QTLマッピング	連鎖地図作成と同様の方法で遺伝子型を決定した後、R/qtlを用いてQTL領域を推定致します。

2.価格と納期

(注4)　ライブラリー調製のみのご依頼は承っておりません。

3.解析参考例

お知らせ：なんでもかんでもアンプリコンシーケンスにお米のRAD-seq解析事例をアップしました→お米のRAD-seq

GRAS-Di®解析

解析事例-1）GRAS-Di®技術による解析

【GRAS-Di®解析ソフトウェアを用いた結果】

デモデータをご覧いただけます（エクセルファイル）

系統解析

解析事例-2）植物の地域個体群を解析

【系統樹作成】

各サンプルのジェノタイプ結果（エクセル形式）からホモのSNPのみを抽出し、連結された配列（テキスト形式）から系統樹を作成します。
※上記の系統樹とは異なるサンプル名での例となっております。

structure解析

解析事例-3）各イネ品種の遺伝的構成の違い

【structure解析】

遺伝的指数の算出

解析事例-4）各イネ品種の遺伝的指数

【遺伝的指数の算出】

Obs_Het（ヘテロ接合度の観察値）：遺伝子座がヘテロ接合である割合
Exp_He（ヘテロ接合度の期待値）：対立遺伝子頻度から計算したヘテロ接合度の割合
Pi（塩基多様度）：ランダムに抽出した2つの配列間で異なっている割合
Fis（近交係数）：分集団内で近親交配が進んでいるか判断できます
Fst（固定指数）：集団間が遺伝的に離れているか判断できます

デモデータをご覧いただけます（エクセルファイル）

連鎖地図作成・QTLマッピング

解析事例-5）ある特徴的な性質をもった魚類の解析

野生型88個体、変異型96個体を解析し、連鎖地図作成およびQTLマッピングを行った。

4.よくある質問

Q1.シーケンス解析の生データも納品してもらえますか？

はい。fastq形式の配列データを納品しています。

Q2.推奨のDNA抽出キットはありますか？

特にございません。市販のDNA抽出キットであればどれをご使用いただいても問題ないと思います。

Q3.GRAS-Di®解析のデモデータはありますか？

はい、ご用意しています。上部「3.解析参考例」をご覧ください。

Q4.3種の解析方法の違いを教えてもらえますか？

下記に比較表をご用意しました。その他ご不明点はお気軽にお問合せください。

RAD-seq解析・GRAS-Di®解析・MIG-seq解析の比較
	RAD-seq解析	GRAS-Di®解析	MIG-seq解析
ライブラリー作製様式	制限酵素	PCR
塩基解読する領域	制限酵素部位の間	ランダム	単純反復配列(SSR)の間
得られる多型の数	多い（-100,000 SNPs）		少ない（-1,000 SNPs)
適した解析名	遺伝子地図作成やqtl解析、集団解析		集団解析
必要DNA量	多い（100ng以上）	少ない（15ng）	少ない（2-100ng）
DNAの品質	高品質のDNA量が必要		低品質のDNAでも可
費用	高い	安い

5.ちらしPDF

　GRAS-Di・MIG-seq・RAD-seq解析のパンフレットPDF

6.お問合せ・サンプル送付先

お見積り依頼

GRAS-DiR解析・MIG-seq解析・RAD-seq解析 見積依頼フォーム

お問合せ

お問合せフォーム、メール（dna@gikenbio.com）、または　お電話（042-780-8333）でお気軽にご相談ください。

サンプル送付先

株式会社生物技研
〒252-0154　神奈川県相模原市緑区長竹657　/　TEL 042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。
＜添付書類＞
・依頼書→dna@gikenbio.comへ送信ください。あわせて、サンプル送付時に印刷したものを同封ください。