環境DNA 網羅的解析(メタバーコーディング解析)

網羅的環境DNA 網羅的解析(メタバーコーディング解析)

次世代シーケンサーを用いた解析です。環境中のDNAを網羅的なプライマーセットでPCR増幅した後、シーケンシングします。得られた塩基配列をデータベースと照らし合わせ、生物相を解析します。

1. 環境DNA 網羅的解析(メタバーコーディング解析)概要

価格 30,000円/サンプル(税別)
底生動物の解析は、35,000円/サンプル(税別)
<内訳>
・ろ過 4,000円/サンプル
・DNA抽出 6,000円/サンプル
・メタバーコーディング解析 20,000円/サンプル(底生動物の解析は25,000円/サンプル)
納期 20営業日
解析可能な
生物種
動物(COI)
魚類(cMiFish)更新!※1
哺乳類(MiMammal)※2
節足動物(gInsect)※3
鳥類(gBird)※3・4
二枚貝(gClam)※3
巻貝(gSnail)※3
有尾目<イモリ類とサンショウウオ類>(gSalamander)※3
無尾目(gFrog)※3
環形動物(gWorm)※3
線虫((Ecdysozoa)※3
陸上植物(gPlant)※3
光合成生物(psbA)※3
褐藻(gKasso)※3
紅藻(gKoso)※3
真核生物 (18S rRNA)
底生動物(gBenthos)※3・5
上記以外の生物種についてはご相談ください。
(  )は使用するプライマーセット名または解析対象領域の名称です。
オプション 1st PCR 8反復: +5,000円/サンプル(税別)
より正確なデータを得るため、弊社の環境DNAメタバーコーディング解析では1st PCRを4反復行います。
得られたPCR産物は1つにまとめられ、2nd PCRに使用されます。
1st PCRをさらに4反復増やす上記のオプションは、サンプリングした環境中で存在割合の低い生物種をより検出したい場合にご利用をオススメしています。
プライマー追加: +2,000円/依頼(税別)
cMiFishに円口類(スナヤツメやヌタウナギなど)プライマーを追加するオプションです。

※1 2020年5月よりプライマーセットの名称・混合内容が変わります。
旧)淡水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R (Miya et al., 2015)を1:1で混合
海水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R (unpublished primer)を2:1:1で混合
新)cMiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R 、MiFish-Ayu&Wakasagi(unpublished primer)を4:2:2:1で混合
※2 弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。
※3 自社で開発したプライマーセットでの解析です。
※4 鳥類は環境DNAへの移行が少なく、検出が困難な傾向にあります。
※5 節足動物、環形動物、貝(二枚貝・巻貝)が解析対象です。
gBenthosの解析では、複数のプライマーをミックスして1stPCRを行います(マルチプレックスPCR)。PCRの原理上、存在量の多い生物のDNAは増幅されやすく、存在量の少ない生物のDNAは、増幅されにくくなる可能性があります。
例)サンプル中に貝類のDNAが多数存在し、節足動物のDNAが少ない場合は、PCRを行っても貝類由来DNAばかり増幅され、節足動物由来のDNAがほとんど得られません。この場合、節足動物用プライマー(gInsect)のみでPCRを行うと節足動物由来DNAが増幅されたケースがございます。

環境DNA用ポータブルチューブポンプ貸出

2. 環境DNA メタバーコーディング解析の流れ

 

(お客様)サンプルの送付

 

水サンプル(1 L)を冷蔵便で送付下さい。
必ず「サンプル情報提供用紙」を同封してください。
冷蔵保管と発送が難しい場合は下記を参考にしてください。
環境DNA解析用の水サンプルの保管と発送方法について
ろ過
フィルターを用いて、ろ過を行います(弊社標準フィルターは、ステリべクス-GP 0.22μmです。水の濁度が高いなど、標準フィルターだけではろ過が難しい場合は、プレフィルターも用いてろ過を行います)。
DNA抽出(注1)
フィルターに捕集された物質からDNAを抽出します。抽出DNAからPCR阻害物質を除去した後、DNA濃度を測定します。

 

メタバーコーディング解析

 

 

ライブラリー作製
12S rRNAやCOI領域などを対象として、2-step tailed PCRを行い、ライブラリーを作製します。その後、ライブラリーの濃度と品質を確認します。
シーケンシング解析
MiSeqシステムとMiSeq Reagent Kit v3 (Illumina)を用いて、2×300 bpの条件でシーケンシングを行います。
データ解析
DADA2法を用いて、得られたリードをoperational taxonomic unit (OTU)にまとめます。OTUとリード数をまとめた表をご提供します。また、データベースの配列と97%以上の相同性があるOTUは、種名を併記します。

注1)抽出されたDNAは、メタバーコーディング解析だけでなく リアルタイムPCR解析にも使用することが可能です(追加料金: 20,000円/サンプル・生物種)。

●使用機器イルミナMiSeq
Illumina社の次世代シーケンサーMiSeqを使用します。

3. 環境DNA メタバーコーディング解析の具体例

各OTUに対して、検出されたリード数と対応する生物種を示した「エクセルデータ」を提供致します。また、データベースの配列と98%以上の相同性があったOTUのみ相同性トップ10まで和名を明記致します。

例1)相模湾における魚類相の推定 >>詳しいデータをご覧いただけます。 >>相模川版もあります
sagamiwan
相模湾
各サンプル地点おける各生物種由来のリード数を示しています。プライマーは、MiFish (Miya et al., 2015)を使用しました。

例2)哺乳類相の推定  >>詳しいデータをご覧いただけます。
哺乳類解析結果
各サンプル地点おける各生物種由来のリード数を示しています。プライマーは、MiMammal (Ushio et al., 2016)を使用しました。

例3)節足動物相の推定  >>詳しいデータをご覧いただけます。
節足動物相解析データ
各サンプル地点おける各生物種由来のリード数を示しています。プライマーは、Insect(弊社にて開発)を使用しました。

例4)動物相の推定  >>詳しいデータをご覧いただけます。
COI
各サンプル地点おける各生物種由来のリード数を示しています。COI増幅プライマー(Leray et al., 2013)を使用しました。

 

 

4. パンフレット

eDNAパンフレット環境DNA解析のパンフレットPDF

 

5. お問合せ・お見積り依頼

●お問合せ・お見積り依頼

お問合せフォーム、メール(dna@gikenbio.com)、または お電話(042-780-8333)でお気軽にご相談ください。

●サンプル送付先

2019年6月10に移転しました。送付先が変更になっていますので、ご注意ください。
株式会社生物技研
〒252-0154 神奈川県相模原市緑区長竹657 / TEL 042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。

<添付書類>
サンプル情報提供用紙(環境DNA用)→サンプル送付時に同封ください。

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