●プライマー配列（5’→3’）/アンプリコンシーケンス解析（illumina MiSeq）用
IntF：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC
HCOm：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-TAHACTTCNGGGTGKCCRAARAATCA
細字：アダプター配列（2nd PCR用のプライマーとの相同部分）
太字：COI との相同配列
●参考文献
Leray M et al. Frontiers in Zoology (2013) 10:34 （IntF)
●1stPCR後の増幅長
約430 bp
1stPCRの反応組成と反応条件例
以下は、 PCR 酵素に ExTaq HS [TaKaRa]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。
●反応組成
- 10x Ex buffer
- 2.0 ul
- dNTPs (each 2.5 mM)
- 1.6 ul
- 10 uM Forward primer
- 1.0 ul
- 10 uM Reverse primer
- 1.0 ul
- 10 uM Blocking primer
- 8.0 ul
- Template DNA (1ng)
- 1.0ul
- ExTaq HS[TaKaRa]（5 U/ul)
- 0.2 ul
- 滅菌蒸留水
- 5.2 ul
- Total
- 20 ul
●反応温度
- 94°C
- 2min
- 94°C
- 30sec｜
- 67°C※1
- 15sec｜
- 52°C
- 30sec｜30-35 cycles
- 72°C
- 30sec｜
- 72°C
- 5min
※1 ブロッキングプライマー配列に応じて変更してください。
