16S rRNA V3/V4領域:341f-805r プライマー情報

●プライマー配列(5’→3’)/アンプリコンシーケンス解析(illumina MiSeq)用
1st_PCR_V3V4f_MIX(341f):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNNCCTACGGGNGGCWGCAG
1st_PCR_V3V4r_MIX(805r):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNNGACTACHVGGGTATCTAATCC

細字:アダプター配列(2nd PCR用のプライマーとの相同部分)
赤字 N:シーケンス解析時における品質向上を目的として、0-5塩基の異なる長さのランダム配列が挿入された混合プライマーです
太字:16S rRNA との相同配列

●参考文献
Illumina Inc. Part #15044223 Rev.B

●1stPCR後の増幅長
約530 bp

1stPCRの反応組成と反応条件例

以下は、 PCR 酵素に KOD FX Neo [TOYOBO]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。

●反応組成

2× PCR Buffer for KOD FX Neo
10.0 ul
dNTPs (each 2 mM)
4.0 ul
10 uM Forward primer
0.4 ul
10 uM Reverse primer
0.4 ul
Template DNA (0.5 ng)
2.0ul
KOD FX Neo (1.0 U/uL)[TOYOBO]
0.4 ul
Nuclease-Free Water
2.8 ul
Total
20.0 ul

 

●反応温度

94°C
2min
98°C
10sec|
55°C
30sec|25-35 cycles
68°C
30sec|
68°C
7min

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