●プライマー配列(5’→3’)/アンプリコンシーケンス解析(illumina MiSeq)用
1st_PCR_515F_MIX:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNNN–GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
1st_PCR_806R_MIX:
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-NNNNN–GGACTACHVGGGTWTCTAAT
細字:アダプター配列(2nd PCR用のプライマーとの相同部分)
赤字 N:シーケンス解析時における品質向上を目的として、0-5塩基の異なる長さのランダム配列が挿入された混合プライマーです
太字:16S rRNA との相同配列
●参考文献
Caporaso et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108 Suppl1:4516-4522.
●1stPCR後の増幅長
約370 bp
1stPCRの反応組成と反応条件例
以下は、 PCR 酵素に KOD FX Neo [TOYOBO]を使用した例です。
他の PCR 酵素を使用する場合は、そのPCR酵素推奨の反応組成・反応条件で調製してください。
●反応組成
- 2× PCR Buffer for KOD FX Neo
- 10.0 ul
- dNTPs (each 2 mM)
- 4.0 ul
- 10 uM Forward primer
- 0.4 ul
- 10 uM Reverse primer
- 0.4 ul
- Template DNA (0.5 ng)
- 2.0ul
- KOD FX Neo (1.0 U/uL)[TOYOBO]
- 0.4 ul
- Nuclease-Free Water
- 2.8 ul
- Total
- 20.0 ul
●反応温度
- 94°C
- 2min
- 98°C
- 10sec|
- 50°C
- 30sec|25-35 cycles
- 68°C
- 30sec|
- 68°C
- 7min