ロングアンプリコン解析（PacBio Revio / Sequel）
Contents
1.ロングアンプリコン解析（PacBio Revio / Sequel IIe）サービス概要
| プラン | 説明 | 取得リード数 | 価格（税別） | 納期 |
|---|---|---|---|---|
| 16S rRNA V1-V9 | 16S rRNAのV1-V9領域（約1,500 bp）を解析します | 3万リード程度 | 1～7サンプル： 8～23サンプル： 24サンプル以上： ※キャンペーンは、2024年10月28日～2025年2月28日に弊社到着サンプルが対象です。 |
30営業日 |
| 18S rRNA Long （真核生物が対象） ★2024.05 New★ |
18S rRNAのほぼ全長（約1,800 bp）を解析します | |||
| Fungi ITS Long （真菌が対象） ★2024.05 New★ |
ITS1領域とITS2領域を含む（約1,600 bp）を解析します | |||
| カスタムロングアンプリコン | 多様な配列の解析を目的とし、任意の領域（1 kb～数 kbまで）を解析したい場合に適しています。 10 kb以上の場合はご相談ください。 |
3万リード程度 | 1～7サンプル： 70,000円/サンプル 8～23サンプル：60,000円/サンプル 24サンプル以上：50,000円/サンプル |
プライマー合成完了後、PCR条件検討 20営業日 ＋ 解析 30営業日 |
| ＋初期費用 ●プライマー合成*1 20,000円/プライマー ●PCR条件検討*2 100,000円/プライマー |
*1 5’末端にAmino Modifier C6修飾プライマーを合成する必要があるため、プライマー合成費用が初期費用としてかかります。プライマー配列をご指定ください。プライマー設計からのご相談も承っています。
＊2 ご指定のプライマー（NGS用のタグは付加されていないプライマーでOK）で対象領域が増幅できることを確認済であり、PCR反応条件の情報をご提供いただける場合、PCR条件検討費用は不要です。条件検討についての注意事項は、以下「3.よくある質問」のQ2とQ3をご覧ください。
| 作業内容 | 送付DNAの品質確認（蛍光法による2本鎖DNAの定量および電気泳動による断片長の確認を行います） シーケンスライブラリー作製（PCR法でライブラリーを作製します） シーケンシング解析（PacBio Revio または Sequel IIeを用いてHiFiリードを取得します） データ解析（系統解析を行います） ＜系統解析に用いるデータベース＞ 細菌16S rRNA：MIrROR 18Ｓ rRNA：SILVA Fungi ITS：UNITE その他（virus等含む）：NCBI ●データ解析は以下に変更可能です |
|---|---|
| 納品物 | 以下のデータをダウンロード形式で納品します。但し、データ量が４GBを超える場合は、記録媒体での納品に変更させていただきます。 ・報告書 ・シーケンス生データ（fastq形式） ・系統解析結果 ・DDBJのデータベース登録に必要なデータ |
| ご提供 サンプル |
抽出DNA 濃度1 ng/ul以上で液量20 ul以上、かつ対象領域の2倍以上のDNA断片長が確認できていること ●複数プラン（複数領域）ご依頼の方 |
| ご依頼の流れ | まずは、お見積りをご依頼ください。お見積り依頼フォームをご用意しています。 |
2.オプション（DNA抽出＆データ解析）
| 項目 | 備考 | 価格（税別） | 追加 納期 |
|---|---|---|---|
| DNA抽出 | 試料を送付いただき、弊社でDNA抽出を行います。 | 1～ 2サンプル 10,000円/サンプル 3～ 7サンプル 24,000円/式 8サンプル～ 3,000円/サンプル |
5営業日 |
| 群間比較解析 ※細菌16S/18S/真菌ITSのみ対応 |
LEfSeを使って比較する群間の違いと相関を示す微生物群の抽出やある現象の原因微生物の探索を行います。 | 1比較目 30,000円/解析 ※追加1比較ごと10,000円 |
なし |
| 多様性解析 | Qiime2のdiversityプラグインを用いて、レアファクション解析（chao1やshannonなど）と主座標分析（PCoA）を行います。 | 10,000円/解析 | なし |
| ┗多様性解析の統計解析 | ベータ多様性はPERMANOVAで検定し、アルファ多様性はKruskal-Wallisで検定します。 | 20,000円/解析 ※複数領域のご注文時など2解析目以降は10,000円/解析 |
なし |
| 機能予測解析 ※細菌16Sのみ対応 |
PICRUSt2を用いて、菌叢解析結果を特定の機能（酵素・KEGG ID・代謝パスウェイ）へと紐づける予測を行います。サンプルのグループ分けをご指示いただくことで、グループ単位での比較が可能です。 | 30,000円/解析 | なし |
| ┗機能予測解析の統計解析※細菌16Sのみ対応 | STAMPを用いて、比較するグループ間で機能予測解析結果に有意な差がみられるかを検定します。 | 1比較目 30,000円/解析 ※追加1比較ごと10,000円 |
なし |
| 変異点解析 | 参照配列に対して変異箇所を同定します（vcf形式）。 | 5,000円/サンプル | なし |
| ┗サンプル間の変異解析 | 各サンプルの変異箇所を統合して比較します。 | 10,000円/参照配列 | なし |
3.よくある質問
Q1.同じくロングリードを取得できるナノポア社のシーケンサーでの解析と何が違うの？
リードの精度が圧倒的に違います。
PacBio Revio / Sequel lleを用いたシーケンシング解析で取得できる「HiFiリード」はイルミナ社のショートリード以上の精度です。
Q2.PCR条件検討を自分で行う場合、注意すべきことはある？
平滑末端となるPCR酵素を使用してください。
PacBioでは平滑末端のPCR産物のみシーケンシング可能です。
そのため、PCR条件検討の際も、平滑末端となるPCR酵素を使用してください。
＜平滑末端となるPCR酵素の例＞
・KAPA HiFi HS ReadyMix[日本ジェネティクス]
・TaKaRa Ex Premier DNA Polymerase[TaKaRa]
・KOD FX Neo[TOYOBO]
・Q5 High-Fidelity DNA Polymerase[NEB]
・Phusion Hot Start II DNA Polymerase[Thermo Fisher Scientific]
※Taqポリメラーゼは不適です。
Q3.PCR条件検討で増幅が確認できました。何を伝えればいい？
反応条件・反応組成・使用酵素をご連絡ください。
Q4.1 kb未満のアンプリコンは解析依頼できない？
サンプル数やシーケンシング解析の相乗りサンプルによりますので、ご相談ください。
シーケンシング解析時、短いリードほど多く読まれます。例えば、600 bpのアンプリコンと3 kbのアンプリコンを相乗りでシーケンシング解析すると、データ出力に極端なバラツキが出てしまいます。そのため、通常受入れ可能なアンプリコンサイズとして、1 kb以上を目安とさせていただいております。
1 kb未満のアンプリコンでも、同程度の長さでサンプル数が集まれば、シーケンシング可能ですので、ご相談ください。
4.ちらしPDF
PacBioを用いたロングアンプリコン解析のパンフレットPDF
5.お問合せ・サンプル送付先
●お見積り依頼
お見積りフォームがございます。
・ロングアンプリコン解析（PacBio）お見積りフォーム
●お問合せ
お問合せフォーム、メール（dna@gikenbio.com）、または お電話（042-780-8333）でお気軽にご相談ください。
●サンプル送付先
株式会社生物技研
〒252-0154 神奈川県相模原市緑区長竹657 / TEL 042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。
＜添付書類＞
依頼書→dna@gikenbio.comへ送信ください
