環境DNA 網羅的解析（メタバーコーディング解析）

次世代シーケンサーを用いた解析です。環境中のDNAを網羅的なプライマーセットでPCR増幅した後、シーケンシングします。得られた塩基配列をデータベースと照らし合わせ、生物相を解析します。

1. 環境DNA　網羅的解析（メタバーコーディング解析）概要

価格	27,000円/サンプル(税別）底生動物の解析は、32,000円/サンプル(税別）＜内訳＞・ろ過　4,000円/サンプル・DNA抽出　3,000円/サンプル・メタバーコーディング解析　20,000円/サンプル（底生動物の解析は25,000円/サンプル）
納期	20営業日
納品物	以下のデータをダウンロード形式で納品いたします。・報告書・シーケンス生データ（fastq形式）・データ解析結果（エクセルファイル）・DDBJのデータベース登録に必要なデータ
解析系がある生物種	動物(COI) 魚類(cMiFish)※1 哺乳類(MiMammal)※2 節足動物(gInsect)※3 鳥類(gBird)※3･4 二枚貝(gClam)※3 巻貝(gSnail)※3 有尾目<イモリ類とサンショウウオ類>(gSalamander)※3 無尾目(gFrog)※3 環形動物(gWorm)※3 線虫((Ecdysozoa)※3 陸上植物(gPlant)※3 光合成生物(psbA)※3 褐藻(gKasso)※3 紅藻(gKoso)※3 真核生物 (18S rRNA) 底生動物(gBenthos)※3・5 上記以外の生物種についてはご相談ください。 (　 )は使用するプライマーセット名または解析対象領域の名称です。
オプション	プライマー追加： +2,000円/依頼(税別） cMiFishにヤツメウナギ類用のプライマーを追加するオプションです。※6
	MiFish定量解析：10,000円/サンプル　納期＋5営業日 DNAコピー数を算出するオプションです。

※1　2020年5月よりプライマーセットの名称・混合内容が変わります。
旧）淡水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R (Miya et al., 2015)を1:1で混合
海水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R (unpublished primer)を2:1:1で混合
新）cMiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R 、MiFish-Ayu&Wakasagi(unpublished primer)を4:2:2:1で混合
※2　弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。
※3　自社で開発したプライマーセットでの解析です。
※4　鳥類は環境DNAへの移行が少なく、検出が困難な傾向にあります。
※5　節足動物、環形動物、貝(二枚貝・巻貝)、十脚甲殻類が解析対象です。プライマー配列やPCR条件は開示していませんので、あらかじめご了承ください。
gBenthosの解析では、複数のプライマーをミックスして1stPCRを行います（マルチプレックスPCR）。PCRの原理上、存在量の多い生物のDNAは増幅されやすく、存在量の少ない生物のDNAは、増幅されにくくなる可能性があります。
例）サンプル中に貝類のDNAが多数存在し、節足動物のDNAが少ない場合は、PCRを行っても貝類由来DNAばかり増幅され、節足動物由来のDNAがほとんど得られません。この場合、節足動物用プライマー（gInsect）のみでPCRを行うと節足動物由来DNAが増幅されたケースがございます。
※6　環境DNA分析技術を用いた淡水魚類調査手法の手引き第１版に記載されているプライマーセットでの解析です。

2. 環境DNA　メタバーコーディング解析の流れ

（お客様）サンプルの送付		水サンプル(1 L)を冷蔵便で送付下さい。必ず「依頼書(環境DNA用)」を同封してください。冷蔵保管と発送が難しい場合は下記を参考にしてください。環境DNA解析用の水サンプルの保管と発送方法について
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ろ過		フィルターを用いて、ろ過を行います（弊社標準フィルターは、ステリべクス-GP 0.22μmです。水の濁度が高いなど、標準フィルターだけではろ過が難しい場合は、プレフィルターも用いてろ過を行います）。
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DNA抽出（注1）		フィルターに捕集された物質からDNAを抽出します。抽出DNAからPCR阻害物質を除去した後、DNA濃度を測定します。
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メタバーコーディング解析	ライブラリー作製	12S rRNAやCOI領域などを対象として、2-step tailed PCRを行い、ライブラリーを作製します。その後、ライブラリーの濃度と品質を確認します。1stPCRは８反復実施します。
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	シーケンシング解析	Illumina NextSeq1000またはMiSeqを使用してシーケンシング解析を行います。2x300bpのpaired-endリードを取得します。
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	データ解析	DADA2法を用いて、得られたリードをamplicon sequence variant (ASV)にまとめます。ASVとリード数をまとめた表をご提供します。また、データベースの配列と97%以上の相同性があるASVは、種名を併記します。