GRAS-Di®技術による解析・MIG-seq解析・RAD-seq解析

塩基多型を検出し、得られたSNPマーカーを用いて、系統解析や連鎖地図作成、QTLマッピングを行います。
解析内容（目的や対象生物、サンプル数など）をお知らせください。最適なプランをご提案いたします。

GRAS-Di®とは？
グラスディーアイと読み、トヨタ自動車株式会社が開発した技術です。
ランダムプライマーを用いてPCRすることにより、ゲノムの複数個所を増幅します。ゲノムワイドに増幅されたアンプリコンを次世代シーケンサーで解析した後、同社が独自開発したソフトウエアでジェノタイピング解析を行います。得られる解析結果は、アンプリコン増幅の再現性が高く、ジェノタイプデータの欠損が少ないのが特徴です。
※GRAS-Di®はトヨタ自動車株式会社の登録商標です。
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GRAS-Di®解析ソフトウェアによる解析は弊社にご依頼いただくことが可能です。
また、以下の通りソフトウェアの販売もしております。
・GRAS-Di®解析のソフトウェア　400,000円（税別）
・再解析用GRAS-Di® Analysisのソフトウェア　100,000円（税別）

1.GRAS-Di®解析・MIG-seq解析・RAD-seq解析の概要

		RAD-seq解析	GRAS-Di®解析	MIG-seq解析
価格（税別）	ライブラリー調製※1	50,000円/8サンプル	25,000円/8サンプル	25,000円/8サンプル
	シーケンス解析	48サンプルまでは一律72,000円 48サンプル以上 12,000円/8サンプル	48サンプルまでは一律72,000円 48サンプル以上 12,000円/8サンプル	48サンプルまでは一律72,000円 48サンプル以上 12,000円/8サンプル
納期※2		25営業日	30営業日	25営業日
データ量		1サンプルあたり100万リード程度
ご提供サンプル		ゲノムDNA >10ng/µl, >20µl	ゲノムDNA >15ng/µl, >20µl	ゲノムDNA >1ng/µl, >20µl
		・冷蔵便または冷凍便で（株）生物技研へ送付ください。8連チューブまたはプレートでお願いします。 ・GRAS-Di解析の場合は、DNA濃度測定の際のブランク用に溶出バッファーを100 ul程度サンプルと一緒にご送付ください（難しければ、バッファーの情報の提供をお願いします）。 ・サンプル送付時に、当社指定の依頼書（エクセル）をご提出ください。依頼書はお見積り時に添付します。
作業内容		送付サンプル（DNA）の濃度測定
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		ddRAD法を用いてライブラリーを作製します。使用する制限酵素はMspIと EcoRIの組み合わせですが、別の制限酵素からお選び頂くことも可能です。	トヨタ自動車株式会社のプロトコールに従い、ライブラリーを作製します。 ①と②の２通りの方法があります。①イルミナ社のアダプター配列を付加したプライマーを用います。※3・4 ②DNBSEQのアダプター配列を付加したプライマーを用います。※3	Suyama et al., 2021. と同様の方法を用いて、ライブラリーを作製します。
		↓	↓	↓
		シーケンシング解析（DNBSEQ 150 bpペアエンド解析）
納品物		以下のデータをDVD等の記録媒体に保存して納品します。 ・報告書 ・シーケンス生データ（fastq形式） ・DDBJのデータベース登録に必要なデータ
ご依頼の流れ		まずは、お見積りをご依頼ください。お見積り依頼フォームをご用意しています。

※1　ライブラリー調製のみのご依頼は承っておりません。
※2　500サンプルまでの納期です。500サンプル超の場合は追加納期がかかります。
※3　弊社の試験では、①と②では異なる部位がシーケンシングされることがわかりました。継続的な解析の場合、以前と同一メーカーのアダプターを付加したプライマーを用いる方法をご選択ください。
※4　①は、リン酸化されたプライマーで2ndPCRを行った後、環状化させてDNBSEQでシーケンス解析します。イルミナ社シーケンサーでシーケンス解析した場合と同等の結果が得られることを検証済です。

2.オプション

項目	オプション追加可否			価格（税別）	追加納期
	RAD-seq	GRAS-Di	MIG-seq
DNA抽出	〇	〇	〇	1～2サンプル　10,000円/サンプル 3～7サンプル　24,000円/式 8サンプル～　3,000円/サンプル	5営業日
GRAS-Di®解析ソフトウェアによる解析		〇		100,000円	なし
連鎖地図作成	〇	〇		200,000円	なし
QTLマッピング	〇	〇		200,000円	なし
集団構造解析 ＜パッケージ内容＞ ・系統解析 ・structure解析 ・遺伝的指数の算出 ・Neighbor-net	〇	〇	〇	1～96サンプル　120,000円	なし
				97～480サンプル　200,000円	10営業日
				481～960サンプル　300,000円	20営業日
				961サンプル～　要相談	要相談

3.オプションデータ解析の具体例

GRAS-Di®解析

GRAS-Di®解析ソフトウェアを用いて、アンプリコンごとのリード数やその配列、増幅断片のサイズ、遺伝子型などをExcelファイルで納品します。
デモデータをご覧いただけます（エクセルファイル）

連鎖地図作成・QTLマッピング

解析事例）ある特徴的な性質をもった魚類の解析

野生型88個体、変異型96個体を解析し、連鎖地図作成およびQTLマッピングを行った。
【連鎖地図作成】
Bowtieを用いてレファレンスにリードをマップした後、samtoolsとbcftoolsを用いて、SNPを検出致します。その後、vcftoolsを用いてSNPのフィルタリングを行います。遺伝子型データをもとにJoinmapを使用して、連鎖地図を作成致します。

【QTLマッピング】
連鎖地図作成と同様の方法で遺伝子型を決定した後、R/qtlを用いてQTL領域を推定し、1,000回の並び替え検定で、5％有意水準を算出します。

集団構造解析（系統解析・structure解析・遺伝的指数の算出・Neighbor-net のパッケージ）

異なる手法による解析結果をパッケージ化してご提供します。複数の解析手法を併用することで、結果の整合性を検討することが可能です。また、単一手法では得られない多面的な知見の取得も期待できます。

【系統解析】
IQ-treeを用いた最尤法により系統樹を作成します。この手法は、種間の進化的関係だけでなく、種の分類の再評価、品種間や集団間の類縁関係の解明にも利用されます。

各サンプルのジェノタイプ結果（エクセル形式）からホモのSNPのみを抽出し、連結された配列（テキスト形式）から系統樹を作成します。
※上記の系統樹とは異なるサンプル名での例となっております。

【structure解析】
structureを使用して、各個体が遺伝的に類似したクラスター（仮想的な祖先集団）に由来する確率を推定します。
同じクラスターに高い確率で属する個体同士は遺伝的に類似していると考えられます。

【遺伝的指数の算出】
得られたSNPデータとグループ分け情報に基づき、Stacksを用いて集団内および集団間（総当たり）の遺伝的指数を算出します。
これらの指数は、集団の遺伝的多様性や近交の程度、 集団構造の評価に利用されます。

Obs_Het（ヘテロ接合度の観察値）：遺伝子座がヘテロ接合である割合
Exp_He（ヘテロ接合度の期待値）：対立遺伝子頻度から計算したヘテロ接合度の割合
Pi（塩基多様度）：ランダムに抽出した2つの配列間で異なっている割合
Fis（近交係数）：分集団内で近親交配が進んでいるか判断できます
Fst（固定指数）：集団間が遺伝的に離れているか判断できます

デモデータをご覧いただけます（エクセルファイル）

【Neighbor-net】
個体間の遺伝的距離をもとに、系統関係をネットワークで表現します。一般的な系統樹が二分岐の連続で表現されるのに対し、ループや交差を含むネットワーク構造で表現されるため、交雑、網状進化など複雑な進化の可視化に適しています。
近縁種間の系統解析や、種内の集団遺伝学的解析に用いられます。

デモデータをご覧いただけます（エクセルファイル）

4.よくある質問

FAQsページをご覧ください。

 

5.ちらしPDF

　GRAS-Di・MIG-seq・RAD-seq解析のパンフレットPDF

6.お問合せ・サンプル送付先

お見積り依頼

GRAS-DiR解析・MIG-seq解析・RAD-seq解析 見積依頼フォーム

お問合せ

お問合せフォーム、メール（dna@gikenbio.com）、または　お電話（042-780-8333）でお気軽にご相談ください。

サンプル送付先

株式会社生物技研
〒252-0154　神奈川県相模原市緑区長竹657　/　TEL 042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。