1.Iso-seq解析（ロングリードRNA-seq解析・PacBio Sequel lle）サービス概要

対象生物	真核生物のみ。 cDNA合成にoligo dTを用いているので、polyAを持たない生物はLib調製できず解析不可となります。
価格（税別）	★2024.09 相乗りプラン登場★ 100万リード　420,000円/サンプル 200万リード　525,000円/サンプル 500万リード程度（１セル占有）※1　800,000円/セル 取得データ量は全遺伝子数の20-50倍が目安です。
納期	30営業日 ※3セル以上の場合は要相談
作業内容	・送付サンプル（トータルRNA）の品質確認 ・オリゴdTプライマーでcDNA合成 ・シーケンスライブラリー作製 ・シーケンシング解析（PacBio Revio Iso-seq解析） ・データ解析 リードの振り分けおよびIndex配列の除去を行った後、完全長リードのノイズを除去します。Iso-Seq3を用いて、フィルタリングした完全長リードをクラスタリングします。 その後、参照配列がある場合は、pbmm2を用いてクラスタリングしたhq.fastaを参照配列にマッピングを行います。Iso-Seq3を用いて、固有のアイソフォームに分類します。参照gtfもある場合は、SQANTI3を用いて、統合したアイソフォームをアノテーションします。
納品物	以下のデータをDVDやUSB等の記録媒体に保存して納品します。 ・シーケンス生データ（fastq＆bam形式） ・クラスタリングの結果 (エクセルファイルとfasta形式) ・DDBJのデータベース登録に必要なデータ —– 参照配列がなければ納品物はここまで —– ・固有のアイソフォームの分類データ(gff形式など) ・Mappingの結果(bam形式) ・参照配列（fasta&fasta.fai形式） —– 参照配列があるが、参照gtfがなければ納品物はここまで —– ・Annotation結果（エクセルファイル） ・参照遺伝子アノテーション（gtf形式） —– 参照配列とgtfともがあれば納品物はここまで —–
ご提供 サンプル	トータルRNA 1 μg以上/1セル（＞50ng/ul、＞20ul） ※RNase-free waterに溶解した状態で冷凍便を使用して送付ください。
ご依頼の流れ	まずはお問合せフォームからお見積りをご依頼ください。

※1　サンプルに依存するため、データ量の保証はできません。また、1サンプル分のライブラリー調製費用は上記に含まれています。複数サンプルご依頼の場合は、2サンプル目以降からライブラリー調製費用100,000円/サンプルが別途必要です。

2.オプション

項目		備考	価格（税別）	追加 納期
RNA抽出		QIAGEN社のRNeasy等を使用して、トータルRNAを抽出します。 ＜ご提供サンプル量の目安＞ 酵母：細胞数 5×10^7程度、湿重量 25 mg程度 植物（葉）：湿重量 50 mg程度、直径1.5cm 動物細胞：細胞数 1×10^7程度、湿重量 20 mg程度 動物組織：湿重量 20 mg程度	20,000円/サンプル	5営業日
発現プロファイルの類似性		発現比較解析前に各サンプルの遺伝子プロファイルの類似性をいくつかの手法で可視化し、反復内や反復間で遺伝子発現の差を確認します。 (主成分分析、相関分析、階層的クラスタリング)	30,000円 ※3サンプル以上で解析可	なし
発現比較解析		統計解析によって発現量が有意に異なる遺伝子群を特定した後、それをMA plotやVolocano plot、ヒートマップで描写します。	1比較目30,000円 ※追加1比較ごと+10,000円	なし
┗ エンリッチメント解析		発現変動した遺伝子群が、どのような機能をもつのか体系的に分類し、有意差検定を行います。また、KEGGの代謝マップ上に可視化するための情報を納品します。 (Gene Ontology(GO)解析、パスウェイ解析)	1比較目50,000円 ※追加1比較ごと+10,000円	なし

3.具体例

標準解析

遺伝子発現行列データをエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます

サンプル毎にどの遺伝子に何リードマッピングされたかを示しています。また、RPKM/TPM正規化後の数値も示しています。

発現プロファイルの類似性（オプション）

主成分分析

1.相関行列をエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます

2.主成分分析の結果をpng形式で納品します。

階層的クラスタリング

クラスタリングの結果をpng形式で納品します。

発現比較解析（オプション）

1.遺伝子発現比較解析の結果をエクセルデータで納品します。>>詳しいデータをご覧いただけます

===データの見方===
-sample_name: 正規化前のリードカウント
– a.value: log2(平均発現量)
– m.value: log2(発現比)
– p.value: p値
– q.value: q値 (false discovery rate(FDR))
– rank: p値が低い順にランク付けされています。
– estmatedDEG: 「1」は発現変動遺伝子(q<0.05)、「0」は発現変動遺伝子ではないこと(q>0.05)を示します。

2.MAプロットの図をpng形式で納品します。
横軸がlog2(平均発現量(A))、縦軸がlog2(発現比(M))を示しています。

Volcanoプロット

Volcano プロットをpng形式で納品します。
Volcano プロット は、MAプロットの親戚の図です。volcano plotは横軸がlog2(発現比)、縦軸がp値を示しています。

ヒートマップ

Treeview用のデータを納品します。
そのデータを使用して、お客様自身でご希望のヒートマップ図を作成いただけます。

エンリッチメント解析

パスウェイ解析

パスウェイ解析の結果をテキストデータで納品します。エクセルで開くことができます。>>詳しいデータをご覧いただけます

Gene Ontology（GO）解析

Gene Ontology（GO）解析の結果をエクセルデータで納品します。

4.よくある質問

Q1.推奨のRNA抽出キットは？

特にございません。弊社ではQIAGEN社のRNeasyシリーズを使用することが多いです。

Q2.DNase処理は必要？

ゲノムDNAの混入は望ましくないので、DNase処理をお勧めします。

Q3.送付の際、バッファーは何でもよい？

滅菌水のほか、Tris や TE 、抽出キットの溶出バッファーでも構いません。但し、塩濃度が高いバッファーの場合、QCの電気泳動がうまくいかない可能性がありますので、避けてください。

Q4.RIN値の目安は？

バイオアナライザーのRIN値で7以上が目安です。送付前にお客様側でも品質確認される際は、参考にしてください。

Q5.送付時の温度帯は？

●total RNA送付の場合
冷凍便を利用し、必ずドライアイスを同梱してください。

●生サンプル送付（弊社にRNA抽出もご依頼）の場合
◇RNAlaterなどの核酸保存液に浸しているサンプル
冷凍便を利用し、ドライアイスは同梱せずに送付してください（核酸保存液は-20℃以下で凍結してしまうため）。
◇-80℃で保存していたサンプル
冷凍便を利用し、必ずドライアイスを同梱してください。

Q6.オプションのデータ解析は必要？

必要かどうかは目的によります。
オプションを付けない標準のRNA-seq解析でも遺伝子の発現量やざっくりとした遺伝子発現の違いは明らかにできます。
それが統計的に有意かどうか解析する場合に「発現比較解析」が必要になります。
「発現比較解析」は発現量に有意差のある遺伝子(発現変動遺伝子)をリストアップするだけですので、同定された発現変動遺伝子の代謝系における役割や機能的グループを明らかにしたい場合は、それぞれ「パスウェイ解析」や「GO解析」を行う必要がある、といった使い分けになります。「パスウェイ解析」では発現変動遺伝子が代謝系のどの部分が変動しているのかが分かり、「GO解析」では発現変動遺伝子がどのような機能をもったグループが多いかが分かります(出現頻度の解析)。

Q7.発現比較解析などのパターン数って？

3群間比較（A群 VS B群 VS C群）も可能ですが、発現比較の発現平均値（A値）と発現比（M値）が算出されないため、MAプロット図の納品はなく、エクセルデータのみの納品となります。

5.お問合せ・サンプル送付先

お見積り・お問合せ

お問合せフォーム、メール（dna@gikenbio.com）、または　お電話（042-780-8333）でお気軽にご相談ください。

サンプル送付先

株式会社生物技研
〒252-0154　神奈川県相模原市緑区長竹657　/　TEL　042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。

＜添付書類＞
・依頼書→dna@gikenbio.comへ送信ください。あわせてサンプル送付時に印刷したものを同封ください。