これまでシーケンサーはMiSeqのみでしたが、
2024年8月頃よりNextSeq1000が稼働しました。
いずれも、2×300 bpの条件でシーケンシングを行います。
本解析サービスの特徴
・1サンプルでもご注文可能です。
・データ解析までサービスに含まれたパッケージサービスです。
・すべての工程を国内（自社内）で行うから、短納期です。
・腸内細菌相や土壌細菌相などの微生物相だけでなく、あらゆる生物相に対応。プライマー配列のご指定も可能です。
Contents
1.アンプリコンシーケンス解析のサービス概要
| 試料を送る | 抽出DNAを送る | 1stPCR産物を送る | |
|---|---|---|---|
| 価格（税別） | 120,000円/8サンプル | 96,000円/8サンプル | 72,000円/8サンプル |
| 納期 | 20営業日（注1） | 15営業日（注1） | 12営業日（注1） |
| 作業内容 | DNA抽出～データ解析 | DNAの濃度測定～データ解析 | 1stPCR産物の精製～データ解析 |
| ご提供サンプルと送付方法 | 試料（注2）：弊社提供のチューブの半分程度 | 抽出DNA：濃度0.5 ng/ul以上、液量20 ul以上 ※濃度は、蛍光法を用いた2本鎖DNAの定量結果を基準としています。 260 nmの吸光度ベースで定量されている場合、上記より高めの濃度（5 ng/ul以上）が望ましいです。 |
1stPCR産物（精製前）：液量 15 ul以上 |
 必ず弊社提供の粉砕用1.5 mlチューブをご使用ください。試料の種類（土壌、糞便など）と数をお知らせください。送料は弊社負担でお送りします。＜量の目安＞ 湿土壌 200-500 mg程度 マウス糞便 米粒大2-3粒 |
濃度を0.5 ng/ulに調製していただく必要はありません。また、基準濃度未満でも、受け入れています。 | アダプター配列付きのプライマーを弊社からご提供します（1,500円 ※送料込）。ご希望の遺伝子領域をお知らせください。 = 1stPCR産物（未精製）の濃度測定は不要です。できれば電気泳動を行い、目的の増幅産物が得られていることをご確認ください。 |
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| 冷凍便で送付ください。 | 冷蔵便 or 冷凍便で送付ください（保存時と同じ温度帯がベストです）。 サンプル数が多いとき（目安：16サンプル以上）は8連チューブやプレートで送付ください。 |
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| シーケンシング条件 | illumina社MiSeqまたはNextSeq1000を用いて、2×300 bpの条件でシーケンシングを行います（他のお客様と相乗り）。 | ||
| データ量 | 1サンプルあたり3～5万リードペア程度 | ||
| 納品物 | ダウンロード形式での納品となります。 圧縮後のデータ量が2GBを超える場合は記録媒体での納品に変更させていただきます（目安は96サンプル） ・報告書 ・シーケンス生データ（fastq形式） ・系統解析結果 ・DDBJのデータベース登録に必要なデータ 納品データのサンプル |
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| ご依頼の流れ | まずはお見積りをご依頼ください。お見積り依頼フォームをご用意しています。 | ||
注1）納期は初回のPCRで良好な増幅が確認された場合です。再調製が必要な場合は追加日数をいただきます。2プレート（192サンプル）までは本納期で対応します。
注2）弊社からご提供させていただく専用チューブに入れて発送いただきます。サンプルの形状等により弊社で追加の作業が必要と判断した場合は別途料金をいただきます。また、サンプルの内容（例えば感染性の有無）によりお断りする場合がございます。
DNA 抽出は、対象生物やサンプルの状況によって抽出方法を最適化する必要がございます。より良いデータを得るための非常に重要なステップであると位置づけております。この観点から弊社におけるDNA抽出ノウハウに乏しいサンプルについてはお断りさせていただく場合がございます。
2.アンプリコンシーケンス解析の流れ
| DNA抽出 | 弊社は、糞便や土壌、水など様々なサンプルからの抽出実績があり、それぞれのサンプルに最適な抽出方法で行います。その後、DNA濃度を測定します。＞＞弊社のDNA抽出方法について、詳しくはこちら |
| ↓ | |
| ライブラリー作製 | PCR反応と精製を2回行い(2-step tailed PCR）、ライブラリーを作製します。その後、ライブラリーの濃度と品質を確認します。 |
| ↓ | |
| シーケンシング解析 | MiSeqまたはNextSeq 1000(Illumina)を用いて、2×300 bpの条件でシーケンシングを行います（他のお客様と相乗り）。 |
| ↓ | |
| 標準データ解析（系統解析） | 菌叢解析用パイプラインQiimeを用いて解析を行い、「菌相組成の棒グラフ」や「ヒートマップ」などの形でデータの可視化まで行います。一部の遺伝子領域(12S rRNAやCOIなど)は、「エクセルデータ」のみを提供いたします。 ※Qiime2.0（DADA2モデル）が標準です。Qiimeでの解析をご希望の方はお知らせください。追加料金は発生しません。※QIIME1とQIIME2の違いについてはこちら — 解析に用いるデータベース ●細菌16S rRNA：Greengene・SILVA・Human Oral Microbiome Databaseより選べます。特にご指定がない場合は、Greengeneを用いて解析します。 EzBioCloud 16S Databaseを用いる場合は+10,000円/解析かかります。 ●真菌ITS：UNITE ●18S rRNA：SILVA ●cMiFish：魚類ミトコンドリアゲノムデータベースMitoFishとMiFish用参照配列 ●その他：NCBI |
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ゲノム編集結果の確認や多型を知りたい方には、「CRISPResso2を用いた解析」や「カスタム多型解析」がオススメです。 いずれも追加料金はかかりません。お見積り時にどちらかご希望をお知らせください。デモデータは弊社HPにご用意しています。 |
 ★ブラウザ上でデモデータをご覧いただけます（菌相組成の棒グラフ・OTU heatmap・サンバーストチャート）  ★デモデータをご覧いただけます（MiFish・MiMammal・gInsect・COI） |
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| ↓ | |
| （オプション） 群間比較解析 ※細菌16S/真菌ITS/18Sのみ対応 |
LEfSeを使って比較する群間の違いと相関を示す微生物群の抽出やある現象の原因微生物の探索を行います。 有意差検定を行うため、解析には最低6サンプル かつ 1グループ3サンプル以上必要です。 |
 ★群間比較解析の納品データのサンプルをご用意しています。ダウンロードはこちら。 |
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| （オプション） 多様性解析 |
レアファクション解析(chao1やshannonなど)と主座標分析 (PCoA)の結果を提供いたします。サンプルのグループ分けをご指示いただくことで、グループ単位での比較が可能です。 |
 ★ブラウザ上でデモデータをご覧いただけます（主座標分析・レアファクションカーブ） |
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| （オプション） ┗ 多様性解析の統計解析 ※多様性解析を行う必要があります |
ベータ多様性はPERMANOVAで検定し、アルファ多様性はKruskal-Wallisで検定します。 主成分分析(PCA)の結果とその結果に信頼楕円(95%)を加えた以下の図も納品します。 有意差検定を行うため、解析には最低6サンプル かつ 1グループ3サンプル以上必要です。  |
| （オプション） 機能予測解析 ※細菌16Sのみ対応 |
PICRUSt2を使って予測メタゲノム解析を行います。 |
 ★機能予測解析＋統計解析の納品データのサンプルをご用意しています。ダウンロードはこちら。 |
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| （オプション） ┗ 機能予測解析の統計解析 ※細菌16Sのみ対応 ※機能予測解析を行う必要があります |
機能予測解析の結果から比較するグループ間で統計的に優位な差がみられるかを検定します。 有意差検定を行うため、解析には最低6サンプル かつ 1グループ3サンプル以上必要です。 |
 ★機能予測解析＋統計解析の納品データのサンプルをご用意しています。ダウンロードはこちら。 |
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| （オプション） コピー数の取得 |
リアルタイムPCR解析を行い、サンプル中の対象遺伝子のコピー数を測定します。アンプリコンシーケンス解析の結果を相対値から絶対値に変換したデータをお返しします。 |
| （オプション） ネットワーク解析 ★2023.05 New★ |
SpiecEasi (MB法) を使用して、ネットワーク解析を行います。経験上、最低8サンプル必要です。 ★ネットワーク解析の納品データのサンプルをご用意しています。ダウンロードはこちら。 |
| （オプション） 生息環境の推測 ※細菌16Sのみ対応 |
16S rRNA遺伝子配列と微生物の生息環境を網羅的に結びつけるデータベース「ProkAtlas」を用いて、生息環境を推測します。 ★生息環境の推測の納品データのサンプルをご用意しています。ダウンロードはこちら。 |
3.料金早見表（税別）
| サンプル数 | 試料を送る |
抽出DNAを送る |
1stPCR産物（精製前）を送る |
|---|---|---|---|
| 1 | 20,000円(@20,000円） | 15,000円(@15,000円） | 15,000円*1(@15,000円） |
| 8 | 120,000円(@15,000円） | 96,000円(@12,000円） | 72,000円*1(@9,000円） |
| 16 | 240,000円(@15,000円） | 192,000円(@12,000円） | 144,000円*1(@9,000円） |
| 24 | 360,000円(@15,000円） | 288,000円(@12,000円） | 216,000円*1(@9,000円） |
| 32 | 480,000円(@15,000円） | 384,000円(@12,000円） | 288,000円*1(@9,000円） |
| 40 | 540,000円(@13,500円） | 420,000円(@10,500円） | 360,000円*1(@9,000円） |
| 48 | 576,000円(@12,000円） | 432,000円(@9,000円） | 384,000円*1(@8,000円） |
| 56 | 616,000円(@11,000円） | 448,000円(@8,000円） | 392,000円*1(@7,000円） |
| 64 | 672,000円(@10,500円） | 480,000円(@7,500円） | 416,000円*1(@6,500円） |
| 72 | 720,000円(@10,000円） | 504,000円(@7,000円） | 432,000円*1(@6,000円） |
| 73～ | ＠10,000円 | @7,000円 | ＠6,000円*1 |
*1 1stPCR用のプライマー送付料金（1,500円/依頼）が別途かかります。
サンプル数が8の倍数でないときも、上記1サンプルあたりの単価で対応します。
例）試料を18サンプル送る場合
16サンプルの場合の単価は@15,000円ですので、15,000円×18サンプル=270,000円（税別）となります。
| サンプル数 | 2ndPCR産物（精製後・混合不要）を送る*2 |
|---|---|
| 1～32 | 受け入れ可能ですが、価格は「1stPCR産物を送る」と同じです。 |
| 33～96 | パッケージではなく、下記項目を足し合わせた価格になります。 ・シーケンシング解析 300,000円/式 ・データ解析 500円/サンプル ・プライマー送付 10,000円/回 例）40サンプル・データ解析ありの場合：300,000+500×40+10,000=330,000円 ◆シーケンシング解析の条件 |
*2 送付するライブラリーの濃度と液量は、10ng/μl以上、20μl 以上でお願いします。精製済のライブラリーをプレート（または8連チューブ）に入れて冷蔵便 or 冷凍便で送付してください。
4.オプション料金表
| 項目 | 価格（税別） |
| 液体サンプルのフィルターろ過 | 4,000円/サンプル |
| PCR阻害物質の除去 | 10,000円/8サンプル |
| 1stPCR 4反復 | 16,000円/8サンプル |
| ライブラリーのビーズ精製（注4） | 5,000円/8サンプル |
| ブロッキング | こちらをご覧ください |
| 残サンプルの返却 ※送料込 | 2,500円/回 ★2024.05 値上げ★ |
| QIIME1に変更 | 0円 |
| EzBioCloud 16S database使用（詳しくはこちら） | 10,000円/解析 |
| 群間比較解析（細菌16S/真菌ITS/18Sのみ可能） | 1比較目 30,000円 ※追加1比較ごと10,000円 |
| 多様性解析(注5) | 10,000円/解析 |
| ┗ 多様性解析の統計解析（多様性解析のオプション） | 20,000円/解析 ※複数領域のご注文時など2解析目は10,000円/解析 |
| 機能予測解析（細菌16Sのみ可能） | 30,000円/解析 |
| ┗ 機能予測解析の統計解析（細菌16Sのみ可能/機能予測解析のオプション） | 1比較目 30,000円 ※追加1比較ごと10,000円 |
| 機能予測解析と群間比較解析のセット割引 | 3割引 |
| コピー数の取得(注5) | ＜リアルタイムPCR解析を1反復実施する場合＞ リアルタイムPCR解析 5,000円/サンプル 検量線作成 20,000円（80サンプルごと） |
| ＜リアルタイムPCR解析を4反復実施する場合＞ リアルタイムPCR解析 8,000円/サンプル 検量線作成 20,000円（20サンプルごと） |
|
| ネットワーク解析 | 50,000円/解析 |
| 生息環境の推測（細菌16Sのみ可能） | 20,000円/解析 |
(注4) 送付いただいたライブラリーが精製不足の場合、弊社で再精製を行います。
(注5) リアルタイムPCR解析と検量線作成の両方が必要です。また、アンプリコンシーケンス解析と同時にご注文いただいた際の価格です。データ解析のみでご依頼の場合は、別途QIIME解析の費用がサンプル数に応じて必要となります。
5.対象遺伝子領域
| ターゲット生物種 | 対象領域 | 納品データ |
| 細菌と古細菌 | 16S rRNA V4領域：515F-806R | 可視化データを納品 |
| 16S rRNA V4領域（ver2）：515F-806RB ★2023.05 New★ 上記515F-806Rの改良版です。海洋表層中の自由生活性細菌であるSAR11クレードのDNAを検出されやすく改変されました。 |
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| 細菌 | 16S rRNA V3/V4領域：341f-805r 16S rRNA V1/V2領域：27Fmod-338R |
|
| 真菌類 | ITS1領域：ITS1F_KYO1 – ITS2_KYO2 （植物由来DNAは増幅しにくい） |
|
| ITS2領域：gITS7 – ITS4 (真菌類を広くカバーしているが、植物由来DNAが増幅する) |
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| ITS2領域：fITS7 – ITS4 (gITSほど真菌類を広くカバーしていないが、植物由来DNAは増幅しにくい) |
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| 真核生物 | 18S rRNA：1422f-1642r | |
| 動物 | COI：IntF-HCOmR | エクセルデータを納品 |
| 魚類（※1） | 12S rRNA (cMiFish) バージョンアップ | |
| 哺乳類（※2） | 12S rRNA (MiMammal) | |
| 節足動物（※3） | 16S rRNA (gInsect) | |
| 鳥類（※3）（※4） | 16S rRNA (gBird) | |
| 二枚貝（※3） | 18S rRNA (gClam) | |
| 巻貝（※3） | 18S rRNA (gSnail) | |
| 有尾目（イモリ類とサンショウウオ類）（※3） | 12S rRNA (gSalamander) | |
| 無尾目（※3） | 16S rRNA (gFrog) | |
| 環形動物（※3） | 16S rRNA (gWorm) | |
| 線虫（※3）（※5） | 18S rRNA (Ecdysozoa) | |
| 陸上植物（※3） | rbcL（gPlant） | |
| 光合成生物（主に単細胞生物）（※3） | psbA：psbA_597f-psbA_927r | |
| 褐藻（※3） | rbcL（gKasso） | |
| 紅藻（※3） | rbcL（gKoso） | |
| カスタム（※6） | 任意の領域 (120～500 bp) ※個別対応させていただきます。 |
※領域による |
※1 2020年5月よりプライマーセットの名称・混合内容が変わります。
旧）淡水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R (Miya et al., 2015)を1:1で混合
海水用MiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R (unpublished primer)を2:1:1で混合
新）cMiFish→MiFish-U-F/RとMiFish-E-F/R-v2、MiFish-U2-F/R 、MiFish-Ayu&Wakasagi(unpublished primer)を4:2:2:1で混合
※2 弊社でのテスト解析の結果、脊椎動物全般が検出されています。
※3 自社で開発したプライマーでの解析です。
※4 鳥類は環境DNAへの移行が少なく、環境サンプルでは検出が困難な傾向にあります。
※5 植物由来DNAも増幅されます。
※6 プライマーの新規合成は5,000円/2本かかります。
6.よくある質問
Q1.納品物の内容は？
A1. ダウンロード形式にて以下を納品します（ただし、圧縮後のデータ量が2GBを超える場合は記録媒体での納品に変更させていただきます）。
＜データ内容＞
・報告書
・シーケンスデータ（fastq形式）
・データ解析結果
エクセルファイルと可視化データ、またはエクセルファイルのみ（遺伝子領域による）
・DDBJのデータベース登録に必要なデータ
Q2.データ量はどれくらい？
A2. 1サンプルあたり3-5万リード程度です（但し、2ndPCR産物を33サンプル以上送付の場合を除く）。
Q3.解析を依頼したいとき、まず何をすればよい？
A3. 弊社HPのお見積りフォームからお見積りをご依頼ください。すぐにチューブやプライマーが必要な方は、その旨もお知らせください。
Q4.DNAサンプルの返却は可能？
A4. 2,500円（送料込・税別）で対応しています。弊社では、解析完了後3カ月経過すると、サンプルを処分しますので、返却希望の場合はお早目にご連絡ください。なお、試料やPCR産物の返却はできません。
Q5.推奨のDNA抽出キットは？
A5.特に推奨はございませんが、DNA精製工程が含まれているキットをお使いください。精製されていないクルードサンプルを送付いただいた場合は、それに対応したPCR酵素を用いる必要がございます。
Q6.データ解析のみを依頼可能？
A6.可能です。他社で取得されたデータでも対応しています。
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9.お問合せ・お見積り依頼
お問合せ・お見積り依頼
お見積り依頼フォームをご用意しています。また、お問合せフォーム、メール（dna@gikenbio.com）、または お電話（042-780-8333）でお気軽にご相談ください。
サンプル送付先
株式会社生物技研
〒252-0154 神奈川県相模原市緑区長竹657 / TEL 042-780-8333
※平日着でお送りください。発送は元払いでお願いしています。
＜添付書類＞
依頼書（試料用・抽出DNA用・1stPCR産物用・ライブラリ用）
→ご記入の上、エクセルファイルのままdna@gikenbio.comにメール送信してください。あわせて、印刷したものをサンプル送付時に同梱してください。
